纯化的pH中性丝核菌属漆酶及编码该酶的核酸制造技术

本发明专利技术涉及分离的、含有编码在中性或碱性ｐＨ下具有最适活性的茄丝核菌漆酶之序列的核酸片段及由其编码的漆酶蛋白质。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分离的编码真菌氧化还原酶的核酸片段及由此产生的纯化的酶。更具体地说，本专利技术涉及编码在中性pH下发挥功能的酚氧化酶(特别是漆酶)的核酸片段。
技术介绍
漆酶(苯二酚氧氧化还原酶)是催化酚醛塑料氧化的含多个铜离子的酶。漆酶介导的氧化导致以合适的酚底物产生芳氧基-基团中间体；所产生的中间体最终偶联而提供一种二聚体-寡聚体和多聚体反应产物的组合物。这类反应在自然界导致黑色素，生成碱，毒素，木质素和腐殖酸形成的生物合成途径中是重要的。漆酶可由很多种真菌产生，包括子囊菌类(如曲霉属、链孢霉属和柄孢壳菌属)、半知菌类葡萄孢属和担子菌类(如金线菌属，屈孔菌属，香茹属，灰侧耳菌属，栓菌属)以及丝核菌属的有性生殖菌形式。漆酶表现出大范围的底物特异性，每种不同的真菌漆酶通常只能按其氧化酚底物的能力以定量的方式来互相区别。由于具有底物多样性，人们普遍发现了漆酶的许多有潜力的工业应用。其中有木质素修饰、纸强化、在去污剂中的染料转移抑制、酚聚合、汁液加工，酚树脂生产和废水处理。尽管催化能力相似，但不同真菌种类产生的漆酶具有不同的温度和pH最适值，这些也可以根据特异性底物来区别。已分离出许多这类真菌漆酶，其中一些基因已被克隆。例如，Choi等(Mol.Plant-Microbe Interactions 5:119-128,1992)描述了编码栗树枯萎病真菌(Cryphonectria parasitica)漆酶的基因的分子特征和克隆。Kojima等(J.Biol,Chem.265:15224-15230,1990；JP2-238885)提供了对白色腐烂病担子菌毛革盖菌漆酶两种等位形式的描述。Germann和Lerch(Experientia 41:801,1985；PNAS USA83:8854-8858,1986)报道了粗糙链孢霉漆酶基因的克隆和部分测序。Saloheimo等(J.Gen.Microbiol.137:1537-1544,1985；WO92/01046)公布了对真菌射脉菌漆酶基因的结构分析。然而，实际上所有已知的真菌漆酶都在酸性pH(例如在pH3.0和6.0之间)下发挥最佳功能，且在中性和碱性pH下一般无活性。由于许多前述有潜力的工业方法优选在中性或碱性pH下进行，在这类方法中大多数真菌漆酶利用效果较差。因此，在许多重要商用方法的应用中，可得到的真菌漆酶是不充足的。这一常规的一个例外是丝核菌属的某些种类所产生的胞外漆酶。Bouag等报道了Rhizoctonia praticola产生的最适pH大约为7.0的漆酶。这种类型的漆酶与以前已知的漆酶相比在需要中性pH的工业方法上更为有用。然而，这种R.Praticola酶既未纯化，也未进一步鉴定，而且到现在为止没有任何其它具有该特征的漆酶被纯化或鉴定。而且，尽管已分离出了其它的漆酶基团(如上所述)，但这些基因编码的酶在酸性pH下发挥最佳功能。因此还不能达到对pH中性或碱性漆酶的重组生产和足够的商用产量，因为该酶本身和编码该酶的漆酶基因以前尚未被分离和/或纯化及测序过。本专利技术现在提供了对这些问题的解决方法。本专利技术概述本专利技术涉及分离的含有编码在pH6.0到8.5之间发挥最佳功能的丝核菌属漆酶的核酸序列的核酸片段。“发挥最佳功能”是指酶在pH范围为大约6.0到8.5之间时表现出明显的(即，至少是最大值的大约30％，优选至少大约50％，最优选从50％到最大值)活性，以诸如丁香醛连氮、ABTS、2,6-二甲氧基酚或4antiaminopy-rine+N-乙基-N-磺基丁基-m-甲苯胺的底物的一种或多种标准漆酶试验中的活性来确定。本专利技术的漆酶优选的底物是丁香醛连氮。在一个优选的实施例中，漆酶是茄丝核菌漆酶。本专利技术还涉及由新核酸序列编码的基本上纯的漆酶。“基本上纯的”指基本上(即≥90％)无其它非漆酶蛋白质的漆酶。为了便于生产新的漆酶，本专利技术还提供了包含所要求保护的核酸片段的载体和宿主细胞，该载体和宿主细胞在漆酶的重组生产中有用处。该核酸片段与触指导漆酶蛋白质在选择的宿主细胞中表达的转录和翻译信号以可操纵的方式相连。优选的宿主细胞是真菌细胞，最优选的是曲霉属。本专利技术的漆酶的重组生产通过在适于漆酶蛋白质表达的条件下培养用于本专利技术的核酸片段转化或转染的宿主细胞或其子代并从培养物中回收漆酶蛋白质来实现。本专利技术的漆酶在许多需要氧化酚醛塑料的工业方法中有用。这些方法包括木质素修饰，汁液加2，酚聚合和酚树脂的生产。在优选的实施例中，本专利技术的酶用于为达到最大效率而需要中性或略带碱性pH的方法中。附图说明图1显示了RSlac1的核苷酸和氨基酸顺序。核苷酸序列中的小写字母表示内含子位置。图2显示了RSlac2的核苷酸和氨基酸顺序。核苷酸序列中的小写字母表示内含子位置。图3显示了质粒pMWR-1的限制性图谱。图4显示了RSlac3翻译区的核苷酸和氨基酸序列。图5显示了RSlac1的丁香醛连氮氧化酶活性(90mM缓冲液，20μm丁香醛连氮，20℃)。图6显示了RSlac2的丁香醛连氮氧化酶活性(93mM缓冲液，20μm丁香醛连氮，20℃)。已报道了生产漆酶的丝核菌属的某些种类；因此，起始研究集中于鉴定在各种茄丝核菌属分离物中这些酶的存在。培养样品并以ABTS方法(在下面描述)定期分析上清液中漆酶的存在。在全部丝核菌属培养物中观察到漆酶。收获的漆酶经电泳分离并用ABTS染色，一种分离物RS22产生具有碱性pI的漆酶，选来进行进一步的研究。后续研究集中于对来自RS22的酶进行纯化和鉴定。简单地说，过滤发酵培养基并用具有以大约10,000倍浓缩的膜的UF进行浓缩。在pH4.5下在乙酸缓冲液中进行第一步离子交换层析步骤，使用NaCl进行洗脱步骤。然后洗脱物经过滤并再进行层析，用NaCl梯度洗脱。汇集活性部分以备进一步研究。首先对由此分离和纯化的完整蛋白质(下文称为RSlac3)进行部分测序，获得的N末端顺序如下AVRNYKFDIKNVNVAPDGFQRPIVSV(SEQ.ID.NO.:5)用赖氨酸或谷氨酸特异性蛋白酶对该蛋白质进行进一步消化，从该蛋白质获得的其它的肽具有下列序列，可与毛革盖菌中的序列进行序列对比肽1:SQYVDGLRGPLVIYDPDDDH(SEQ.ID.NO:6)肽2:GLALVFAEAPSQIRQGVQSVQPDDA(SEQ.ID.NO:7)肽3:SRYBVBBASTVVMLEBWYHTPAXVLE(SEQ.ID.NO:8)肽4:SLGPTPNYVNPXIRDVVRVGGTTVV(SEQ.ID.NO:9)还发现了下列多肽，但与革盖菌属序列不相关。肽5:IRYVGGPAVX(N？)RSVI(SEQ.ID.NO:10)肽6:ILANPPA(SEQ.ID.NO:11)肽7:YEAPSLPT(SEQ.ID.NO:12)在上面序列中，B代表天冬氨酸或天冬酰胺的，X代表未确定的残基。为了起动丝核菌属漆酶基因的筛选，制备了茄丝核菌基因组文库。用限制性酶Sau3A部分消化总DNA，在琼脂糖凝胶上光电泳以分离大小，在8和21kb之间的DNA片段。分离的片段以BammHⅠ末端连接到入噬菌体EMBL3臂上，所得的噬菌体进行体外包装。这些噬菌体用作文库以在大肠杆菌中产生170,000噬菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在溶液中聚合木质素或硫酸木质素底物的方法，包含将该底物与在ｐＨ为大约６．０－８．５之间发挥最佳功能的丝核菌属漆酶接触。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：JA瓦雷斯尼尔，BE克里斯蒂森，P施奈德，
申请(专利权)人：诺沃挪第克公司，诺沃挪第克生物技术公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]