Fe制造技术

本发明专利技术涉及一种高活性Fe2+和α‑酮戊二酸依赖型羟化酶的筛选方法，该方法首先构建α‑酮戊二酸脱氢酶编码基因和异柠檬酸裂解酶编码基因缺失菌株，采用易错PCR技术扩增Fe2+和α‑酮戊二酸依赖型羟化酶编码基因获得其突变体并连接至表达载体，然后将其转化至上述α‑酮戊二酸脱氢酶编码基因和异柠檬酸裂解酶编码基因缺失菌株并于含α‑酮戊二酸和相应底物的培养基中筛选生长速度快的菌株，提取其质粒并扩增羟化酶编码基因突变体。实现了高活性Fe2+和α‑酮戊二酸依赖型羟化酶的高通量筛选，加快了该类酶的应用进程。

Fe

The present invention relates to a screening method for highly active Fe2+ and alpha ketoglutarate dependent hydroxylase. The method firstly constructs a strain with deletion of alpha ketoglutarate dehydrogenase coding gene and isocitrate lyase coding gene, and amplifies the coding genes of Fe2+ and alpha ketoglutarate dependent hydroxylase by error-prone PCR technique to obtain their mutants. The recombinant plasmid was then transformed into the deleted strain encoding the gene encoding alpha ketoglutarate dehydrogenase and isocitrate lyase, and the fast growing strain was screened in the medium containing alpha ketoglutarate and the corresponding substrate. The plasmid was extracted and the mutation of the gene encoding the hydroxylase was amplified. High-throughput screening of highly active Fe2+ and alpha-ketoglutarate-dependent hydroxylases was achieved, and the application of these enzymes was accelerated.

【技术实现步骤摘要】
Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶的筛选方法及异亮氨酸羟化酶
本专利技术涉及生物化工领域，尤其是一种高活性Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶的筛选方法及异亮氨酸羟化酶。
技术介绍
羟基化合物是一类重要化合物，尤其是氨基酸羟基化合物由其特有的活性功能而备受关注，在食品、医药、化工、农药都有广泛的应用。如4-羟基异亮氨酸具有葡萄糖浓度依赖的促进胰岛素分泌的活性，增强肌细胞对血糖吸收、促进脂肪代谢、降血脂以及保护肝功能等作用；5-羟基色氨酸具有改善轻度失眠及慢性压力性头痛的功能；羟基脯氨酸具有治疗慢性肝炎、防止肝硬化等作用。相当一部分羟基化合物是由底物在羟化酶催化下合成，其中Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶家族属于重要羟化酶。由于受该类羟化酶活性不足的限制，致使羟基化合物的开发和应用以及工业化生产受到严重制约。而高活性羟化酶筛选方法的缺失，是引起上述问题的主要瓶颈。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种高活性Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶的筛选方法。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供一种异亮氨酸羟化酶。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：一种高活性Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶的筛选方法，具体步骤如下：(1)构建α-酮戊二酸脱氢酶编码基因和异柠檬酸裂解酶缺失菌株；(2)利用易错PCR对羟化酶编码基因进行突变扩增，将产物连接至表达载体，获得含羟化酶基因突变体重组表达载体的连接产物；(3)将步骤(2)中的连接产物转化至步骤(1)中的菌株，并涂布于固体筛选培养基进行初筛；(4)挑选步骤(3)中半径较大的菌落并接种于液体筛选培养基进行复筛；(5)选择步骤(4)中生长快的菌株，提取重组表达载体并PCR扩增其羟化酶基因突变体。优选的，上述高活性Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶的筛选方法，所述步骤(1)中构建的α-酮戊二酸脱氢酶编码基因和异柠檬酸裂解酶缺失菌株，α-酮戊二酸脱氢酶编码基因缺失和异柠檬酸裂解酶基因缺失菌株因琥珀酸缺陷而无法生长，当羟化酶或其突变体转化至所述菌株后，在对底物羟基化的同时，催化自身合成的α-酮戊二酸生成琥珀酸，实现底物的羟基化与细胞生长偶联，该酶突变体活性越高细胞生长越快。优选的，上述高活性Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶的筛选方法，所述步骤(1)中菌株为谷氨酸棒杆菌属(Corynebacteriumgultamicum)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)、白色分枝杆菌属(Mycobacteriumalbum)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)或苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)或蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)及韦氏芽孢杆菌(Bacillusweihenstephanensis)。优选的，上述高活性Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶的筛选方法，所述步骤(1)中α-酮戊二酸脱氢酶编码基因和异柠檬酸裂解酶缺失菌株(即α-酮戊二酸脱氢酶编码基因缺失菌株)的构建步骤如下：(a)人工合成α-酮戊二酸脱氢酶(sucA)基因上的20bp间隔序列，序列如序列表<400>1所示，连接至载体载体pGRB质粒，获得重组质粒pGRB-20bp-sucA，序列如序列表<400>2所示；(b)人工合成α-酮戊二酸脱氢酶(sucA)基因上下游同源序列并重叠，获得sucA基因缺失片段，序列如序列表<400>3所示；(c)将质粒pREDCas9转化至出发菌株，然后将pGRB-20bp-sucA和中sucA基因缺失片段转化至已获得pREDCas9质粒的出发菌株，获得阳性转化子，消除阳性转化子中的氨苄青霉素和盐酸壮观霉素后获得sucA基因敲除菌；(d)在此基础上对步骤(c)所获得sucA基因敲除菌的异柠檬酸裂解酶(aceA)基因进行敲除，方法与敲除sucA相同，即获得sucA和aceA双敲除菌株。优选的，上述高活性Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶的筛选方法，所述步骤(2)中以异亮氨酸羟化酶编码基因ido为原始序列(但不限于异亮氨酸羟化酶)，序列如序列表<400>4所示，进行易错PCR扩增，回收扩增产物连接至质粒pWSK29，获得含羟化酶基因突变体重组表达载体的连接产物。优选的，上述高活性Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶的筛选方法，所述步骤(3)中固体筛选培养基成份为：葡萄糖10g/L，MgSO40.24g/L，Na2PO4·7H2O13g/L，KH2PO42.5g/L，NH4SO45g/L，羟化酶底物2g/L，FeSO42g/L，Vc0.2g/L，琼脂20g/L，自来水1000mL，pH6.5-7.5。优选的，上述高活性Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶的筛选方法，所述步骤(4)中液体筛选培养基为：葡萄糖10g/L，MgSO40.24g/L，Na2PO4·7H2O13g/L，KH2PO42.5g/L，NH4SO45g/L，羟化酶底物2g/L，FeSO42g/L，Vc0.2g/L，自来水1000mL，pH6.5-7.5。α-酮戊二酸脱氢酶编码基因和异柠檬酸裂解酶缺失菌株在筛选高活性Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶方面的应用。一种异亮氨酸羟化酶，是由上述高活性Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶的筛选方法获得的，其序列如序列表<400>5所示。本专利技术的有益效果是：上述高活性Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶的筛选方法，通过构建一株α-酮戊二酸脱氢酶编码基因缺失和异柠檬酸裂解酶基因缺失菌株，使得菌体内琥珀酸的供应不足，使菌体生长受到琥珀酸的严格限制，而Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶在羟基化过程中会生成琥珀酸，这使得异亮氨酸羟化酶变体对底物的羟化与细胞生长偶联，突变体活性越高细胞生长越快。利用该方法获得的异亮氨酸羟化酶，底物亲和性、催化效率和酶活性以及热稳定性显著提高，利用该酶催化5h后可生成158.9mmol/L4-羟基异亮氨酸，提升131.3％。附图说明图1为敲除α-酮戊二酸脱氢酶编码基因(sucA)和异柠檬酸裂解酶基因(aceA)DNA琼脂糖凝胶电泳验证图谱。M:marker，1：敲除前aceA基因；2：敲除后aceA基因；3：敲除前sucA基因；4：敲除后sucA基因图2为经过筛选获得的高活性异亮氨酸羟化酶的生长曲线测量结果。图3温度对IDO和IDOM活性的影响。图4pH对IDO和IDOM活性的影响。图5IDO和IDOM热稳定性。图6利用IDO和IDOM合成4-羟基异亮氨酸的产量。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好的理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施方式对本专利技术所述技术方案作进一步的详细说明。实施例1α-酮戊二酸脱氢酶编码基因缺失和异柠檬酸裂解酶基因缺失菌株的构建(1)用于敲除的同源臂重叠基因片段构建根据序列表<400&g本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高活性Fe2+和α‑酮戊二酸依赖型羟化酶的筛选方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)构建α‑酮戊二酸脱氢酶编码基因和异柠檬酸裂解酶缺失菌株；(2)利用易错PCR对羟化酶编码基因进行突变扩增，将产物连接至表达载体，获得含羟化酶基因突变体重组表达载体的连接产物；(3)将步骤(2)中的连接产物转化至步骤(1)中的菌株，并涂布于固体筛选培养基进行初筛；(4)挑选步骤(3)中半径较大的菌落并接种于液体筛选培养基进行复筛；(5)选择步骤(4)中生长快的菌株，提取重组表达载体并PCR扩增其羟化酶基因突变体。

【技术特征摘要】
2017.12.14 CN 20171133358971.一种高活性Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶的筛选方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)构建α-酮戊二酸脱氢酶编码基因和异柠檬酸裂解酶缺失菌株；(2)利用易错PCR对羟化酶编码基因进行突变扩增，将产物连接至表达载体，获得含羟化酶基因突变体重组表达载体的连接产物；(3)将步骤(2)中的连接产物转化至步骤(1)中的菌株，并涂布于固体筛选培养基进行初筛；(4)挑选步骤(3)中半径较大的菌落并接种于液体筛选培养基进行复筛；(5)选择步骤(4)中生长快的菌株，提取重组表达载体并PCR扩增其羟化酶基因突变体。2.根据权利要求1所述高活性Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶的筛选方法，其特征在于：所述步骤(1)中菌株为谷氨酸棒杆菌属、大肠杆菌、粘质沙雷菌、白色分枝杆菌属、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、球形芽孢杆菌或蜡状芽孢杆菌或韦氏芽孢杆菌。3.根据权利要求1所述高活性Fe2+和α-酮戊二酸依赖型羟化酶的筛选方法，其特征在于：所述步骤(1)中α-酮戊二酸脱氢酶编码基因和异柠檬酸裂解酶缺失菌株的构建步骤如下：(a)人工合成α-酮戊二酸脱氢酶sucA基因上的20bp间隔序列，序列如序列表<400>1所示，连接至载体载体pGRB质粒，获得重组质粒pGRB-20bp-sucA，序列如序列表<400>2所示；(b)人工合成α-酮戊二酸脱氢酶sucA基因上下游同源序列并重叠，获得sucA基因缺失片段，序列如序列表<400>3所示；(c)将质粒pREDCas9转化至出发菌株，然后将pGRB-20bp-su...

【专利技术属性】
技术研发人员：张成林，战俊杰，王道安，何继龙，陈宁，孟静，李英滋，朱福周，李智祥，赵磊，徐庆阳，谢希贤，李燕军，范晓光，马倩，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12