棒状杆菌诱导型启动子及含有该启动子的表达载体与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种棒状杆菌诱导型启动子及含有该启动子的表达载体与应用，所述表达载体转化至谷氨酸棒状杆菌获得的5‑氨基乙酰丙酸生产菌株并利用该菌株发酵法生产5‑氨基乙酰丙酸。用本发明专利技术获得的启动子构建的表达载体，通过肌醇诱导实现基因的可控表达，克服了现用诱导剂异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(Isopropylβ‑D‑Thiogalactoside，IPTG)对菌体细胞生长的抑制作用以及因其价格高昂造成的生产成本高等不足，同时具有稳定性等特性。利用该启动子整合于宿主基因组或将表达载体转化至宿主谷氨酸棒状杆菌构建获得5‑氨基乙酰丙酸生产菌株，其5‑氨基乙酰丙酸产量达到24.2g/L。

Corynebacterium inducible promoter and expression vector containing the promoter and application thereof

The invention relates to an inducible promoter of Corynebacterium glutamicum and an expression vector containing the promoter and its application. The expression vector is transformed into a 5_aminolevulinic acid producing strain obtained by Corynebacterium glutamicum and used to produce 5_aminolevulinic acid by fermentation of the strain. The expression vector constructed by the promoter of the invention can realize gene controlled expression by inositol induction, overcome the inhibitory effect of the current inductor isopropyl beta D thiogalactoside (IPTG) on cell growth and the high production cost caused by its high price. Feet, at the same time have stability and other characteristics. A 5_aminolevulinic acid producing strain was constructed by integrating the promoter into the host genome or transforming the expression vector into Corynebacterium glutamicum. The yield of 5_aminolevulinic acid reached 24.2 g/L.

【技术实现步骤摘要】
棒状杆菌诱导型启动子及含有该启动子的表达载体与应用
本专利技术涉及生物技术生产领域，尤其是棒状杆菌诱导型启动子及含有该启动子的表达载体与应用。
技术介绍
目前工业化生产中多用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG诱导的表达质粒，需要在生产过程中添加IPTG，价格昂贵，不利于工业化生产，并且IPTG对菌体细胞生长影响严重同时发酵液中含有大量残余IPTG，为后期产物的分离提取带来困难。尽管乳糖能够代谢IPTG，但对于大多数棒状杆菌而言，乳糖不能够进入胞内，进一步限制了其在棒状杆菌中的应用。肌醇，也称为环己六醇，属于维生素类，是合成细胞质膜中丰富的磷脂——磷脂酰肌醇所必需的，又是棒状杆菌如脂多糖和脂褐素单胞菌中更复杂的细胞糖脂的前体。此外，肌醇也是咪唑硫醇的结构单元，它是一种对棒状杆菌特异性的低分子量硫醇，对于保护活性氧的类似于真核生物和革兰氏阴性细菌中的谷胱甘肽的破坏作用是必需的。5-氨基乙酰丙酸作为一种具有高附加值的氨基酸衍生物，在医疗和农业方面具有重要的应用价值与开发前景。近年来，作为一种安全、选择性和渗透性好的光动力学药物在医学领域逐渐得到了重视。目前，己经应用于多种癌症的诊断和治疗。在农业上，已经成为一种无公害的绿色农药，作为除草剂、植物生长调节剂等。同时，也是工业上一些有机物合成的中间体。化学合成法反应历程比较长，其反应历程中要不可避免的采取一些有毒且价格昂贵的原料，同时也不可避免的造成环境污染。此外，5-氨基乙酰丙酸的结构中含有活泼的氨基和羧基，合成过程中必须将其保护起来，这样就增加了反应的步骤、副产物和成本，导致得率不高。而目前生物法因生产效率低不能工业化生产需求。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供棒状杆菌诱导型启动子。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供含有上述棒状杆菌诱导型启动子的棒状杆菌诱导型表达质粒。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供利用上述棒状杆菌诱导型表达质粒得到的用于生产5-氨基乙酰丙酸的质粒。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：一种棒状杆菌诱导型启动子Piol，受肌醇诱导调控，其序列如序列表<400>1所示。一种棒状杆菌诱导型表达质粒pIol，含有上述棒状杆菌诱导型启动子。优选的，上述棒状杆菌诱导型表达质粒pIol，是将上述棒状杆菌诱导型启动子插入至质粒pXMJ19的HpaⅠ和HindⅢ酶切位点得到的，其序列如序列表<400>2所示。一种用于生产5-氨基乙酰丙酸的质粒pIolhemAL，在上述棒状杆菌诱导型表达质粒的BamHI和KpnI酶切位点酶切位点插入谷氨酰-tRNA还原编码基因hemA和谷氨酸-1-半醛-氨基转移酶hemL，其序列如序列表<400>3所示，hemA序列如序列表<400>4所示，hemL序列如序列表<400>5所示。上述用于生产5-氨基乙酰丙酸的质粒pIolhemAL的构建方法如下：(1)克隆谷氨酰-tRNA还原编码基因hemA和谷氨酸-1-半醛-氨基转移酶hemL，hemA序列如<400>4所示，hemL序列如<400>5所示；(2)分别将hemA和hemL转接至pIol，pIolhemAL获得其序列如<400>3所示；(3)将pIolhemAL转化至所需大肠杆菌EscherichiacoliDH5α。一株5-氨基乙酰丙酸生产菌株，将上述棒状杆菌诱导型启动子连同其过表达的关键基因整合至宿主基因组，以及含有上述用于生产5-氨基乙酰丙酸的质粒。优选的，上述5-氨基乙酰丙酸生产菌株，关键基因为柠檬酸合酶编码基因gltA、谷氨酸脱氢酶编码基因gdh、苏氨酸输出载体rhtA以及转氢酶pntAB中的一种或几种；其中，gltA序列如序列表<400>6所示，gdh序列如序列表<400>7所示，rhtA序列如序列表<400>8所示，pntAB序列如序列表<400>9所示。优选的，上述5-氨基乙酰丙酸生产菌株，是由下述方法构建得到的：(1)构建含启动子Piol的关键基因整合片段，关键基因包括柠檬酸合酶编码基因gltA、谷氨酸脱氢酶编码基因gdh、苏氨酸输出载体rhtA以及转氢酶pntAB中的一种或几种。gltA序列如<400>6所示，gdh序列如<400>7所示，rhtA序列如<400>8所示，pntAB序列如<400>9所示。(2)将上述整合片段连接至pK18mobsacB获得重组质粒；(3)将上述重组质粒转化至谷氨酸棒杆菌，获得关键基因过表达重组菌株；(4)将pIolhemAL转化至上述重组菌株获得-氨基乙酰丙酸生产菌株。一种应用上述菌株发酵法生产5-氨基乙酰丙酸的方法，利用所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株生产5-氨基乙酰丙酸，具体步骤如下：(1)种子培养：将权利要求5的菌株活化后，接种至装有1L种子培养基的5L发酵罐，流加25％W/V的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在10-20％，通风量1-3m3/h，搅拌转速200-600rpm，32-37℃培养6-8h；(2)发酵罐发酵：以5％-10％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有6L发酵培养基的10L发酵罐进行发酵培养，发酵温度32-37℃，通风量3-5m3/h，搅拌转速100-3000rpm，溶氧维持在10-20％，流加浓度为60-80％W/V的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％W/V，流加25％W/V的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期30-48h；(3)种子培养基成分为：蔗糖10-15g/L，玉米浆15-25mL/L，酵母粉1-6g/L，(NH4)2SO41-4，KH2PO40.5-1.5g/L，MgSO40.1-0.5g/L，FeSO4·7H2O0.01-0.05g/L，MnSO4·H2O0.010.05g/L，pH7.0，0.075MPa高压蒸汽灭菌15min；(4)发酵培养基成分为：葡萄糖15-45g/L，玉米浆5-15mL/L，豆饼水解液5-15mL/L，(NH4)2SO48-20g/L，生物素0.00004g/L，pH7.0-7.2，121℃高温灭菌20min。本专利技术的有益效果是：用本专利技术所述启动子构建的表达载体，通过肌醇诱导实现基因的可控表达，克服了现用诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside，IPTG)对菌体细胞生长的抑制作用以及因其价格高昂和IPTG于发酵液中残留致使分离提取困难造成的生产成本高等不足，同时具有稳定性等特性。利用该启动子整合于宿主基因组或将表达载体转化至宿主谷氨酸棒状杆菌构建获得5-氨基乙酰丙酸生产菌株，将其应用于发酵法生产5-氨基乙酰丙酸中，其5-氨基乙酰丙酸产量达到24.2g/L，解决了发酵法效率低下的问题。附图说明图1肌醇诱导型表达质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种棒状杆菌诱导型启动子Piol，其特征在于：受肌醇诱导调控，其序列如序列表

【技术特征摘要】
2017.12.14 CN 20171133358591.一种棒状杆菌诱导型启动子Piol，其特征在于：受肌醇诱导调控，其序列如序列表<400>1所示。2.一种棒状杆菌诱导型表达质粒pIol，其特征在于：含有权利要求1所述的启动子。3.根据权利要求2所述的棒状杆菌诱导型表达质粒pIol，其特征在于：是将权利要求1所述的启动子插入至质粒pXMJ19的HpaⅠ和HindⅢ酶切位点得到的，其序列如序列表<400>2所示。4.一种用于生产5-氨基乙酰丙酸的质粒pIolhemAL，其特征在于：在权利要求2所述的表达质粒的BamHI和KpnI酶切位点酶切位点插入谷氨酰-tRNA还原编码基因hemA和谷氨酸-1-半醛-氨基转移酶hemL，其序列如序列表<400>3所示，hemA序列如序列表<400>4所示，hemL序列如序列表<400>5所示。5.一株5-氨基乙酰丙酸生产菌株，其特征在于：将权利要求1所述启动子连同其过表达的关键基因整合至宿主基因组，以及含有权利要求4所述的用于生产5-氨基乙酰丙酸的质粒。6.权利要求5所述的5-氨基乙酰丙酸生产菌株，其特征在于：关键基因为柠檬酸合酶编码基因gltA、谷氨酸脱氢酶编码基因gdh、苏氨酸输出载体rhtA以及转氢酶pntAB中的一种或几种；其中，gltA序列如序列表<400>6所示，gdh序列如序列表<400>7所示，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张成林，战俊杰，王道安，李智祥，陈宁，孟静，何继龙，李英滋，朱福周，赵磊，徐庆阳，谢希贤，李燕军，范晓光，马倩，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12