短密木霉的固体培养和液体发酵工艺制造技术

本发明专利技术公开了短密木霉的固体培养和液体发酵工艺。通过筛选短密木霉培养基的最佳基础配料，对接种和孢子培育以及发酵工艺条件等进行优化，确定出短密木霉的最适固体培养和液体发酵条件，并进一步确定了对多种植物病原真菌均具有较好抑制作用的短密木霉GSAAMLSHU‑1菌株生长和产孢的最适条件，为其工业化生产及其推广应用提供依据。

Solid culture and liquid fermentation of Trichoderma viride

The invention discloses a solid culture and liquid fermentation process of Trichoderma viride. The optimum solid culture and liquid fermentation conditions of Trichoderma brevis were determined by screening the optimum basic ingredients of Trichoderma brevis medium, optimizing inoculation, spore culture and fermentation conditions. The strain GSAAMLSHU_1, which had good inhibitory effect on many plant pathogenic fungi, was further determined. The optimum conditions for growth and sporulation provide the basis for its industrial production and its popularization and application.

【技术实现步骤摘要】
短密木霉的固体培养和液体发酵工艺
本专利技术涉及微生物发酵工艺，具体地说，涉及短密木霉的固体培养和液体发酵工艺。
技术介绍
我国是个农业大国，农业是国民经济的基础。有资料记载，我国每年平均发生病虫害约27-28亿亩次，农药使用量逐年增多，80-90年代，每公顷土地用药量从4.65公斤增加到15.9公斤以上，增加了两倍多。20世纪达每公顷20公斤以上。在人口压力大、环境资源紧张、农业基础薄弱，且农业有害生物多发重发频发的严峻形势下，我国粮食生产连续保持增长，化肥农药做出了重要的贡献。农药是重要的农业生产资料，对防病治虫、促进粮食和农业稳产高产至关重要。然而，由于过量和不能合理、适时、对症用药，使得农药利用率不高，带来生产成本增加、农产品农药残留超标、病虫抗(耐)药性上升、次要害虫大发生、作物药害、环境污染等一系列问题。为了减少化学杀菌剂对环境的污染和在农产品中的残留，寻找对环境友好的新型植物病害防治剂受到普遍重视。大量研究表明，生物防治在植物病害的综合治理中有不可替代的重要作用。生物防治，是指利用生物物种间的相互关系，通过有益生物或其他生物来抑制或消灭有害生物的一种防治方法，与传统化学防治相比较，具有无污染、无公害、长效性等优点，具有广阔的发展前景，是实现生态农业的重要保障。目前，许多生防制剂被广泛应用于植物病虫害的防治，并取得了较好的防治效果。在已经研究的生防菌中，木霉属下的若干菌种因具有适应能力强、抗病谱广、拮抗机制多样化而被广泛用于防治植物病害。木霉菌(Trichoderma.spp)因为培养条件简单，繁殖速度快，被公认为可取代化学试剂化用于农作物的保护，到2010年止世界各国己经注册木霉制剂约50种，使用的含木霉成分生物制剂达到100多种。木霉菌属于真菌界，半知菌亚门，丝孢目，木霉属(Trichoderma)，是一种自然界常见的无性、丝状、腐生性真菌。木霉因其能产生多种蛋白酶，有重要的生物技术应用价值，又能抵抗植物病原菌，有显著的生物防治效果，历来为人们重视。木霉对病原菌的作用机制是多种多样的，主要包括抗菌、溶解、竞争、重寄生等。但就特定的木霉菌株来说，则又各具特点，防治效果也是各异的。因此，对具有广谱生防功效的特定木霉菌的菌株生长和产孢最适条件等进行研究，将为有益微生物菌剂生产及其推广应用提供理论依据。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供短密木霉的固体培养和液体发酵工艺。本专利技术的另一目的是提供保藏号CGMCCNO.15391的短密木霉的液体发酵工艺。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供一种短密木霉(Trichodermabrevicompactum)的固体或液体培养基基料，所述基料选自马铃薯、豆腐渣、麦麸、油渣和玉米粉中的至少一种。优选地，所述基料为麦麸、油渣(菜籽饼和/或菜籽粕)或玉米粉。更优选麦麸。本专利技术还提供短密木霉的固体培养基，所述固体培养基是将上述基料加入适量水煮沸后，用纱布过滤，滤汁用水稀释后加入适量琼脂粉，灭菌后冷却制得。所述固体培养基的制备方法如下：取马铃薯200-250g，加入适量水煮沸20-30min后，用4-6层纱布过滤取汁；然后加入琼脂粉15-20g(优选15g)，用水稀释至1000ml，121℃灭菌20-25min后，冷却即得；或者，取豆腐渣、麦麸、油渣或玉米粉50g，加入适量水煮沸20-30min后，用4-6层纱布过滤取汁；然后加入琼脂粉15-20g(优选15g)，用水稀释至1000ml，121℃灭菌20-25min后，冷却即得。本专利技术还提供短密木霉的固体培养方法，将短密木霉接种于上述固体培养基，于20-30℃(优选25-27℃)培养。本专利技术还提供短密木霉的液体发酵培养基，所述液体发酵培养基是将所述固体培养基中的琼脂粉替换成蔗糖或葡萄糖制得。优选地，所述液体发酵培养基的制备方法如下：取马铃薯200-250g，加入适量水煮沸20-30min后，用4-6层纱布过滤取汁；然后加入蔗糖或葡萄糖15-20g，用水稀释至1000ml，121℃灭菌20-25min后，冷却即得；或者，取豆腐渣、麦麸、油渣或玉米粉50g，加入适量水煮沸20-30min后，用4-6层纱布过滤取汁；然后加入蔗糖或葡萄糖15-20g，用水稀释至1000ml，121℃灭菌20-25min后，冷却即得。本专利技术的液体发酵培养基的pH值为3-10，优选pH自然，或pH＝7。本专利技术还提供一种短密木霉的液体发酵工艺，包括以下步骤：A1、菌种活化：将保存在PDA斜面上的短密木霉菌种接入PDA平板中，于20-30℃(优选25-27℃)培养，进行菌种活化；A2、种子液制备：将活化的菌种接入装有100-120mL种子培养液的250mL三角瓶中，于20-30℃，100-200r/min(优选25-27℃，150r/min)振荡培养6d，作为种子液；其中，所述种子液的活菌数为1×106-1×107cfu/mL；A3、摇瓶发酵：按照5-25％(优选15-20％)的接种量将上述种子液转接至装有100-120mL所述液体发酵培养基的250mL三角瓶中，于20-30℃，100-200r/min(优选25-27℃，150r/min)振荡培养3-6d。本专利技术中，所述种子培养液的成分为：酵母粉5g，葡萄糖10g，MgSO4·7H2O0.5g，KH2PO40.5g，无水CaCL20.25g，H2O1000mL，pH自然。本专利技术进一步提供保藏号CGMCCNO.15391的短密木霉(Trichodermabrevicompactum)GSAAMLSHU-1的液体发酵工艺。专利技术人从甘肃省景泰县条山农场马铃薯连作试验田采集的土样中分离纯化得到一株具有广谱拮抗植物病原真菌作用的真菌GSAAMLSHU-1，菌株在PDA培养基上可产生气生菌丝，菌落正面绒毛状至毡状，白色浓厚蓬松，突起于表面，呈明显同心圆状，5d后PDA上长满大量深绿色或黄绿色孢子，背面反面黄褐色。在SNA培养基上长满细微透明菌丝，白色絮状，青绿色孢子，孢子微量，散布于整个平皿，边缘较多，有酒味。分生孢子梗主轴较粗，节较短，侧枝极短粗，分生孢子梗形状似梨形，饱满，基部开始膨大，颈部缢缩，4-8个成为一簇长在各枝端、节点上，整体似葱花。分生孢子卵圆形，光滑。PCR扩增菌株GSAAMLSHU-1的EF-1α基因序列，扩增产物大小为393bp。对扩增产物进行测序，测序结果如SEQIDNO:1所示。与GenBank核苷酸数据库中已有的木霉菌EF-1α基因序列进行比对，GSAAMLSHU-1与GenBank上登录号为AB558910(Trichodermabrevicompactum)、EU280056(T.brevicompactum)、KP985653(T.brevicompactum)、GU592404(T.brevicompactum)、HM234081(T.brevicompactum)的亲缘关系最近，同源性达97％以上。利用DNAstar软件进行聚类分析，构建聚类分析图，发现菌株GSAAMLSHU-1亦与以上亲缘关系最近的短密木霉位于系统发育树的同一分支，聚为一类。以ITS1和ITS4为引物，菌株GSAAMLSHU-1的基因组DNA为模板，进行PCR扩增后，将PCR产物纯化后测序，PCR产物大本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.短密木霉(Trichoderma brevicompactum)的固体或液体培养基基料，其特征在于，所述基料选自马铃薯、豆腐渣、麦麸、油渣和玉米粉中的至少一种；其中，所述油渣为菜籽饼和/或菜籽粕。

【技术特征摘要】
1.短密木霉(Trichodermabrevicompactum)的固体或液体培养基基料，其特征在于，所述基料选自马铃薯、豆腐渣、麦麸、油渣和玉米粉中的至少一种；其中，所述油渣为菜籽饼和/或菜籽粕。2.根据权利要求1所述的基料，其特征在于，所述基料为麦麸、油渣或玉米粉。3.短密木霉的固体培养基，其特征在于，所述固体培养基是将权利要求1或2所述的基料加入适量水煮沸后，用纱布过滤，滤汁用水稀释后加入适量琼脂粉，灭菌后冷却制得。4.根据权利要求3所述的固体培养基，其特征在于，所述固体培养基的制备方法如下：取马铃薯200-250g，加入适量水煮沸20-30min后，用4-6层纱布过滤取汁；然后加入琼脂粉15-20g，用水稀释至1000ml，121℃灭菌20-25min后，冷却即得；或者，取豆腐渣、麦麸、油渣或玉米粉50g，加入适量水煮沸20-30min后，用4-6层纱布过滤取汁；然后加入琼脂粉15-20g，用水稀释至1000ml，121℃灭菌20-25min后，冷却即得。5.短密木霉的固体培养方法，其特征在于，将短密木霉接种于权利要求3或4所述的固体培养基，于20-30℃培养。6.短密木霉的液体发酵培养基，其特征在于，所述液体发酵培养基是将权利要求3或4所述固体培养基中的琼脂粉替换成蔗糖或葡萄糖制得。7.根据权利要求6所述的液体发酵培养基，其特征在于，所述液体发酵培养基的制备方法如下：取马铃薯200-250g，加入适量水煮沸20-30min后，用4-6层纱布过滤取汁；然后加入蔗糖或葡萄糖15-20g，用水稀释至1000ml，121℃灭菌20-25min后，冷却即得；或者，取豆腐渣、麦麸、油渣或玉米粉50g，加入适量水煮沸20-30min后，用4-6层纱布过滤取汁；然后加入蔗糖或葡萄糖15-20g，用水稀释至1000ml，121℃灭菌20-25min后，冷却即得。8.短密木霉的液体发酵工艺，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：王春明，郭成，周天旺，徐生军，荆卓琼，
申请(专利权)人：甘肃省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62