多酚类交联剂及其在制备抗钙化生物瓣膜中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种多酚类交联剂及其在制备抗钙化生物瓣膜中的应用，多酚类交联剂是将多酚类化合物溶于有机溶剂中，然后采用缓冲液稀释制备得到；多酚类化合物选自原花青素、姜黄素、白藜芦醇、葛根素、芦荟素和芦荟大黄素中的一种或多种；抗钙化生物瓣膜的制备方法包括步骤：将完全脱细胞的生物基材料浸入多酚类交联剂中进行交联，结束后进行充分清洗；再浸入PBS溶液和/或D‑Hanks溶液中进行后处理，得到抗钙化生物瓣膜。本发明专利技术提供的抗钙化生物瓣膜具备更好的力学性能及稳定性，能显著减少组织钙化、炎症及血栓，降低生物毒性，大大延长使用寿命，克服传统戊二醛交联方法处理的生物心脏瓣膜材料钙化严重、使用寿命短等缺陷。

Polyphenols crosslinking agent and its application in the preparation of anti calcified bioprosthetic valves

The present invention relates to a polyphenolic crosslinking agent and its application in the preparation of anti-calcification biological valve. The polyphenolic crosslinking agent is prepared by dissolving polyphenolic compounds in organic solvents and diluting them with buffer solution; the polyphenolic compounds are selected from proanthocyanidins, curcumin, resveratrol, puerarin, aloe and aloe vera. One or more of lutein; the preparation method of anti-calcification biovalve includes the steps of immersing completely acellular biomaterials into polyphenol crosslinking agents for cross-linking, and then washing them thoroughly; and then immersing them into PBS solution and/or D_Hanks solution for post-treatment to obtain anti-calcification biovalve. The anti-calcification biological valve provided by the invention has better mechanical properties and stability, can significantly reduce tissue calcification, inflammation and thrombus, reduce biological toxicity, greatly extend service life, overcome the defects of serious calcification and short service life of the biological heart valve material treated by the traditional glutaraldehyde cross-linking method.

【技术实现步骤摘要】
多酚类交联剂及其在制备抗钙化生物瓣膜中的应用
本专利技术涉及生物医学工程学
，具体涉及一种多酚类交联剂及其在制备抗钙化生物瓣膜中的应用。
技术介绍
近年来，全世界范围内心脏瓣膜类疾病的发病率持续升高，美国每年要进行8万例人工心脏瓣膜置换手术，同时大约有2万人直接死于此病。临床上瓣膜性心脏病的常规治疗方案以人工机械瓣膜和人工生物瓣膜置换为主，其中使用人工机械瓣膜的患者需要长期抗凝治疗，术后发生血栓和抗凝并发症的几率较大，因而近年来逐渐被人工生物瓣膜所取代。人工生物瓣膜以牛心包、猪心包为主要来源，经一系列交联及抗钙化处理后去除了免疫原性，保持了材料的原始结构和机械性能，植入后无需终生抗凝，血栓发生率低。戊二醛在近50年以来一直是应用最广泛的化学交联剂，然而经其处理后的人工生物瓣膜晚期钙化现象严重，大量组织基质丢失，生物力学性能下降，瓣叶衰败率高，其中低龄患者更为明显，严重影响患者寿命。此外，残余戊二醛产生的游离醛基具有细胞毒作用，易引发严重反应，直接影响了生物瓣的生物相容性。因此研究者将经戊二醛交联后的生物瓣膜进行后处理，如醇类(如乙醇、丁二醇或丙三醇等)处理、金属离子(如Fe3+、Mg2+、Al3+等)络合磷酸基团、环氧化合物或羟基铬封闭羧基及氨基、α-氨基油酸络合醛基等方法可一定程度上延缓瓣膜发生钙化，但效果十分有限，且新的试剂引入会再次带来生物安全性问题。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术目的在于提供一种多酚类交联剂及其在制备抗钙化生物瓣膜中的应用，以通过采用多酚类天然化合物改性的生物心脏瓣膜材料，具备更好的力学性能及稳定性，能显著减少组织钙化、炎症及血栓，降低生物毒性，从而大大延长使用寿命，克服传统戊二醛交联方法处理的生物心脏瓣膜材料钙化严重、使用寿命短等缺陷。为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：第一方面，本专利技术提供了一种多酚类交联剂，多酚类交联剂是将多酚类化合物溶于有机溶剂中，然后采用缓冲液稀释制备得到；其中，多酚类化合物的质量和有机溶剂的体积的比值为1mg：(0.1～1000)mL。优选地，多酚类化合物选自黄酮类、单宁类、酚酸类和花色苷类中的一种或多种；多酚类化合物选自原花青素、姜黄素、白藜芦醇、葛根素、芦荟素和芦荟大黄素中的一种或多种。优选地，有机溶剂选自乙醇和/或二甲基亚砜；缓冲液选自PBS溶液和/或D-Hanks溶液；多酚类交联剂的浓度为0.001～10.0mg/mL，多酚类交联剂的pH值为5.0～9.0。本专利技术中，PBS磷酸盐缓冲液(1L)的配方组成如下：氯化钠(NaCl)8g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.42g，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.27g，氯化钾(KCl)0.2g；D-Hanks溶液(模拟体液)(1L)的配方组成如下：氯化钠(NaCl)8.0g，磷酸氢二钠七水合物(Na2HPO4.7H2O)0.09g，氯化钾(KCl)0.4g，磷酸二氢钾(KH2PO4)40.06g，氢氧化钠(NaHCO3)0.35g。需要说明的是，多酚类化合物具有抗氧化、强化血管壁、促进肠胃消化、降低血脂肪、增强抵抗力、防止动脉硬化、抗血栓形成等作用，是一类可降解、无毒、无致癌性的天然物质。其中葡萄种子提取物原花青素是一种稳定胶原基质的天然交联剂，毒性远小于戊二醛，经其交联的牛肌腱和心包膜出现更多的胶原表达和沉积，移植后不发生钙化，且机械强度和抗酶降解能力与戊二醛相当。据推测，原花青素中的酚羟基可与生物心脏瓣膜中的胶原蛋白中的-OH、-COOH、ε-氨基团形成稳定的氢键，从而将其交联固定。因此，多酚类化合物可用于猪心包、牛心包、小肠、鱼鳔和肠系膜等人工生物瓣膜材料的交联处理，有效降低生物瓣膜的钙化和退变发生概率的同时大大降低交联剂的生物毒性。第二方面，本专利技术还保护多酚类交联剂在制备抗钙化生物瓣膜中的应用。多酚类交联剂在制备抗钙化生物瓣膜中的应用方法法包括步骤：将完全脱细胞的生物基材料浸入多酚类交联剂中进行交联，交联结束后采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液进行充分清洗；将清洗后的生物基材料浸入PBS溶液和/或D-Hanks溶液中进行后处理，得到抗钙化生物瓣膜。优选地，交联的温度为10～40℃，交联的摇动速度为20～200rpm，交联的时间为1～100h；后处理的时间为2～15天；抗钙化生物瓣膜保存在1～6℃的PBS溶液和/或D-Hanks溶液中备用。完全脱细胞的生物基材料的制备方法包括步骤：S1：将生物基材料剥去表面脂肪，然后依次用去离子水、PBS溶液和/或D-Hanks溶液漂洗数次；其中，生物基材料包括但不限于猪心包、牛心包、小肠、鱼鳔和肠系膜中的一种或多种；S2：将S1处理后的生物基材料采用1％十二烷基磺酸钠(SDS)进行心包细胞脱除，然后采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液漂洗数次，再在室温下使用1％TritonX-100处理0.5～4.0h；S3：将S2处理后的生物基材料采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液在4℃漂洗7～14天，然后采用2U/mLDNase在37℃下以120rpm的转速匀速摇动6～24h；S4：将S3处理后的生物基材料采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液以120rpm的转速摇动5～24h，得到完全脱细胞的生物基材料。需要说明的是，S2中采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液漂洗数次，是为了去除残留SDS溶液；S3中采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液在4℃漂洗7～14天，是为了去除残留溶液和细胞碎片；采用2U/mLDNase在37℃下以120rpm的转速匀速摇动6～24h，是为了脱去细胞核；S4中采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液以120rpm的转速摇动5～24h，是为了彻底去除心包细胞残渣、碎片及游离蛋白质、核酸。优选地，S1中，生物基材料保存在2～10℃的储存运输液中；储存运输液为含有青霉素和链霉素的PBS溶液和/或含有青霉素和链霉素的D-Hanks溶液；含有青霉素和链霉素的PBS溶液或含有青霉素和链霉素的D-Hanks溶液中，青霉素的浓度为100U/mL，链霉素的浓度为0.1mg/mL。需要说明的是，对于猪心包和/或牛心包，也可以将新鲜的猪心和/或牛心保存在上述的2～10℃的储存运输液中，然后在4h内，在无菌环境中，从新鲜猪心和/或新鲜牛心剪取猪心包和/或牛心包，再剥去表面脂肪，然后依次用去离子水、PBS溶液和/或D-Hanks溶液漂洗数次，其也应该在本专利技术的保护范围内。优选地，S2中，心包细胞脱除在室温下进行，心包细胞脱除的过程的摇动转速为0～200rpm，心包细胞脱除的时间为6h。优选地，S4中，将完全脱细胞的生物基材料采用4℃的无菌PBS溶液储存备用。本专利技术提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本专利技术提供的多酚类交联剂是指天然多酚类化合物，具有抗氧化、强化血管壁、降低血脂肪、防止动脉硬化、抗血栓形成等有益功能，同时毒性远低于现有的戊二醛、无致癌性；材料获取方便，产量高，成本低；用多酚类交联剂处理的心包材料出现更多的胶原表达和沉积，移植后不发生钙化，且机械强度和抗酶降解能力与戊二醛相当；(2)脱细胞的生物基材料用于人工心脏瓣膜材料时需要进行交联以去除免疫原性、保持材料的原始结构和机械性能，而戊二醛作为使用最广泛的化学交联剂存本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多酚类交联剂，其特征在于：所述多酚类交联剂是将多酚类化合物溶于有机溶剂中，然后采用缓冲液稀释制备得到；其中，所述多酚类化合物的质量和所述有机溶剂的体积的比值为1mg：(0.1～1000.0)mL。

【技术特征摘要】
1.一种多酚类交联剂，其特征在于：所述多酚类交联剂是将多酚类化合物溶于有机溶剂中，然后采用缓冲液稀释制备得到；其中，所述多酚类化合物的质量和所述有机溶剂的体积的比值为1mg：(0.1～1000.0)mL。2.根据权利要求1所述的多酚类交联剂，其特征在于：所述多酚类化合物选自黄酮类、单宁类、酚酸类和花色苷类中的一种或多种；所述多酚类化合物选自原花青素、姜黄素、白藜芦醇、葛根素、芦荟素和芦荟大黄素中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的多酚类交联剂，其特征在于：所述有机溶剂选自乙醇和/或二甲基亚砜；所述缓冲液选自PBS溶液和/或D-Hanks溶液；所述多酚类交联剂的浓度为0.001～10.0mg/mL，所述多酚类交联剂的pH值为5.0～9.0。4.权利要求1-3任一项所述的多酚类交联剂在制备抗钙化生物瓣膜中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括步骤：将完全脱细胞的生物基材料浸入所述多酚类交联剂中进行交联，交联结束后采用PBS溶液和/或D-Hanks溶液进行充分清洗；将清洗后的生物基材料浸入PBS溶液和/或D-Hanks溶液中进行后处理，得到抗钙化生物瓣膜。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述交联的温度为10～40℃，所述交联的摇动速度为20～200rpm，所述交联的时间为1～100h；所述后处理的时间为2～15天；所述抗钙化生物瓣膜保存在1～6℃的PBS溶液和/或D-Hanks溶液中备用。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述完全脱细胞的生物基材料...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘婧，王志红，秦怡博，冷希岗，孔德领，
申请(专利权)人：中国医学科学院生物医学工程研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12