一种CRISPR分型PCR的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种CRISPR分型PCR的方法及其应用，该方法为一种进行DNA检测和分型的方法。本方法将Cas9蛋白及靶向目标DNA的sgRNA加入常规PCR反应体系，在PCR反应程序前加入一个短时间恒温孵育程序，之后启动常规PCR扩增程序。本发明专利技术公开了的CRISPR分型PCR的方法是一种均相检测技术，即只需一个PCR扩增步骤即可完成检测，本发明专利技术利用了CRISPR技术对DNA的特异性识别切割特性，可以简单、均相、快速、灵敏地对目标DNA进行特异性检测和分型，是一种具有高特异性和灵敏度的DNA检测新方法，通过运用本发明专利技术的方法成功检测临床样品中人HPV DNA。

A method of CRISPR typing PCR and its application

The invention discloses a method for CRISPR typing PCR and its application, which is a method for DNA detection and typing. In this method, Cas9 protein and sgRNA targeting DNA were added into the conventional PCR reaction system. A short incubation procedure was added before the PCR reaction procedure, and then the conventional PCR amplification procedure was started. The CRISPR typing PCR method disclosed in the present invention is a homogeneous detection technique, that is, the detection can be completed by only one PCR amplification step. The method utilizes the specific recognition and cleavage characteristics of the CRISPR technology for DNA, and can detect and type the target DNA in a simple, homogeneous, rapid and sensitive manner. A new method of DNA detection with high specificity and sensitivity can successfully detect human HPV DNA in clinical samples by using the method of the invention.

【技术实现步骤摘要】
一种CRISPR分型PCR的方法及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种基于CRISPR的DNA检测和分型方法，具体为一种CRISPR分型PCR的方法(简称ctPCR方法)及其应用。
技术介绍
对于基础研究、各种检测及诊断应用，DNA检测和基因分型一直很重要。因此，DNA检测和基因分型技术一直受到广泛关注，从而促进了该类技术发展。简而言之，主要有三类DNA检测和基因分型技术被广泛应用。第一种是基于聚合酶链反应(PCR)的各种技术。PCR是最常用的DNA检测和基因分型技术。基于PCR的DNA检测和基因分型主要依赖于特异性引物的设计和多重PCR扩增。PCR检测可以通过传统PCR(tPCR)，定量PCR(qPCR)和最近开发的数字PCR来实现。因为具有明显的优点，如实时检测和高灵敏度，Q-PCR在几乎所有的研究、检测和诊断实验室中得到高度普及。现在已经开发出更准确的数字PCR，作为临床检测工具，具有很大的潜力和优势。然而，PCR技术在用于区分高度相关的基因型时，要受到多重扩增和高度特异性引物的限制。除PCR技术外，DNA微阵列等多种DNA杂交技术也被广泛用于检测和分型DNA。然而，由于其昂贵的设备，复杂的检测流程和不可避免的非特异性杂交，DNA微阵列技术不能像PCR一样成为常规DNA检测和基因分型工具。DNA测序是另一种有效的DNA检测和基因分型技术。特别是随着下一代测序(NGS)技术的出现，诸如IlluminaNovaSeq等NGS平台的DNA测序工具越来越多。然而，由于需要昂贵的设备和化学试剂，它们仍然不能像PCR一样用于常规研究，检测和诊断。因此，相比之下，如果克服了引物设计的限制，PCR仍然是最方便、经济高效的DNA检测和基因分型的平台。Ishino等人于1987年首次在大肠杆菌(E.coli)的基因组中发现了成簇的规律间隔的短回文重复序列，并由Jansen等人在2002年定义为CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat)。CRISPR系统有三种不同类型(I，II和III型)。I型和III型系统需要多种Cas蛋白互相作用才能发挥正常功能，因此要比II型复杂很多。在II型系统中，只需要一种蛋白(Cas9)，Cas9与引导RNA(gRNA)结合后能够特异地识别和切割双链DNA(dsDNA)。Cas9是II型系统的标志蛋白，在反式激活crRNA(tracrRNA)和CRISPRRNA(crRNA)的引导下发挥作用。tracrRNA能够激活Cas9核酸酶，crRNA特异地与靶DNA的20个核苷酸序列互补。因此crRNA决定了CRISPR-Cas9系统的特异性。将tracrRNA和crRNA整合成一个RNA即单导向RNA(sgRNA)后，极大地简化了II型CRISPR系统的应用。Cas9介导的位点特异性切割依赖于sgRNA和PAM(protospaceradjacentmotif)。如果目标DNA中有PAM，在sgRNA的引导下，Cas9在PAM上游三个碱基处切割靶DNA。目前，由于简便和高效，CRISPR-Cas9系统已被许多研究者广泛应用于基因组编辑领域。另外,dCas9(deadCas9)是由Cas9改造而成，其失去了核酸酶活性，但保留基因转录激活结构域(AD)或抑制结构域(ID)，dCas9(deadCas9)作为一种新的人工转录因子已被广泛应用于内源性基因表达调控。尽管Cas9/sgRNA已广泛应用于基因编辑和调控，但很少应用于核酸检测。凭借高特异性的DNA切割能力(能够区分单碱基)，Cas9/sgRNA在DNA检测和分型上有具有很大的潜力。例如，CRISPR-Cas9系统已被用于检测Zika病毒并且能够对美国和非洲Zika病毒进行分型(SciTranslMed.2017,9(388).pii:eaag0538.doi:10.1126/scitranslmed.aag0538)。基于CRISPR的高特异性，CRISPR-Cas9在区分病毒株时可以达到单碱基的分辨率，可以在单碱基水平上对直系同源的细菌和病毒进行分型检测。目前，随着Cas9蛋白的商业化生产，基于Cas9的DNA检测技术逐渐迎来新的发展。例如有报道将Cas9/sgRNA用于处理血液游离DNA(cfDNA)，用以消除野生型基因型，便于富集ctDNA中的疾病相关突变型基因型，使突变型基因型可用PCR扩增进行检测(Oncogene，2017，36：6823-6829)。此外，我们将PCR技术与Cas9/sgRNA系统项结合，已经发展了两种新的DNA检测及分型技术，被命名为“CRISPR-分型PCR(CRISPR-typingPCR，ctPCR)”；这些技术已经申报了国家专利技术专利(201711146674.2、201711156103.7)，并发表了学术论文(AnalBioanalChem,2018,DOI:10.1007/s00216-018-0873-5；biorxiv:doi:https://doi.org/10.1101/236588)。为了便于区分和反映技术间的差异和改进，将上述两项研究专利技术的ctPCR称为ctPCR1.0(biorxiv:doi:https://doi.org/10.1101/236588)和ctPCR2.0(AnalBioanalChem,2018,DOI:10.1007/s00216-018-0873-5)。基于CRISPR系统对核酸分子的序列特异性切割功能，CRISPR系统在核酸检测领域的应用正在逐步被开发。除了上述Cas9酶之外，其他Cas蛋白的应用也已经展现了在CRISPR系统在核酸检测领域的应用价值。例如，最近III型CRISPR系统的Cas13a(也称C2c2)已经应用于Zika病毒的检测并且具有超高灵敏度(病毒颗粒的量低至2aM)(该方法被命名为Sherlock)(Science.2017；356(6336):438-442.doi:10.1126/science.aam9321；Science，2018，eaaq0179；DOI:10.1126/science.aaq0179)。但Sherlock技术由于依赖只能切割RNA的cas13a酶，只能用于检测RNA；若要检测DNA，需要运用重组酶扩增(RPA)技术先对DNA进行等温扩增，扩增期间通过引物在扩增产物末端引入T7启动子序列，再进行体外转录，产生RNA，之后对RNA进行cas13a特异切割，进而激活cas13a对单链RNA的非特异性切割活性，达到检测DNA的目的。该检测技术依赖于重组酶扩增及体外转录，虽有利于提高检测额灵敏度，但检测过程繁琐，成本高。此外，基于Cas12a(也称为Cpf1)特异性切割靶双链DNA(dsDNA)后会非特异性单链DNA(ssDNA)的特性，发展了用于检测靶DNA分子的新技术(该方法被命名为Detectr)(Science，2018，DOI.10.1126/science.aar6245)。Detectr技术可检测amole级的分子，具有很高的灵明度，但Detectr像Sherlock一样，也依赖于一个核酸等温扩增过程，成本高且费本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CRISPR分型PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)建立CRISPR分型PCR反应：将CRISPR相关核酸酶、靶向目标DNA的sgRNA及PCR反应试剂加入PCR反应体系中建立CRISPR分型PCR反应体系；(2)运行CRISPR分型PCR程序：建立CRISPR分型PCR反应体系后在PCR反应程序前加入一个短时间恒温孵育程序，之后启动PCR扩增程序。

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR分型PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)建立CRISPR分型PCR反应：将CRISPR相关核酸酶、靶向目标DNA的sgRNA及PCR反应试剂加入PCR反应体系中建立CRISPR分型PCR反应体系；(2)运行CRISPR分型PCR程序：建立CRISPR分型PCR反应体系后在PCR反应程序前加入一个短时间恒温孵育程序，之后启动PCR扩增程序。2.根据权利要求1所述的CRISPR分型PCR的方法，其特征在于，步骤(1)所述CRISPR相关核酸酶包括Cas9蛋白，或与Cas9类似的CRISPR相关核酸酶Cpf1。3.根据权利要求1或2所述的CRISPR分型PCR方法，其特征在于，步骤(1)所述靶向目标DNA的sgRNA为CRISPR相关核酸酶匹配的引导RNA，靶向目标DNA的sgRNA为一条sgRNA或多条sgRNA。4.根据权利要求1所述的CRISPR分型PCR的方法，其特征在于，步骤(1)所述PCR反应试剂包括普通PCR反应试剂、荧光定量PCR反应试剂或数字PCR反应试剂。5.根据权利要求4所述的CRISPR分型PCR的方法，其特征在于，步骤(1)所述PCR反应试剂优选为定量PCR反应试剂。6.根据权利要求1所述的CRISPR分型PCR方法，其特征在于，步骤(1)所述PCR反应试剂中的PCR引物为单一序列引物或是简并序列引物；CRISPR分型P...

【专利技术属性】
技术研发人员：王进科，张贝贝，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32