从血浆中提取蛋白质的方法技术

从血浆产生包括α‑1‑蛋白酶抑制剂、γ球蛋白、白蛋白和其它蛋白质的蛋白质产品的方法包括以下步骤：(1)向血液产品中加入盐产生第一中间产物，其中盐占所述第一中间产物重量的11‑13％；(2)分离所述第一中间产物产生第一上清液和第一糊沉淀；(3)向所述第一中间产物中加入盐制备第二中间产物，其中盐占所述第二中间产物重量的21‑23％；(4)分离所述第二中间产物产生第二上清液和第二糊沉淀；(5)通过亲和层析从所述第二上清液分离第三中间产物；和(6)通过离子交换色谱分离所述第三中间产物产生含有蛋白质产品的洗脱液。本发明专利技术的方法有利于简单并且以高产率生产α‑1‑蛋白酶抑制剂、γ球蛋白、白蛋白和其他蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从血浆中提取蛋白质的方法
本专利技术的领域为用于提高α-1-蛋白酶抑制剂(也称为α-1抗胰蛋白酶)或其他蛋白质产品的纯度和产量的改进方法。
技术介绍
以下
技术介绍
讨论包括可能有助于理解本专利技术的信息，并非承认本申请提供的任何信息为现有技术或与当前要求保护的专利技术相关，或者明确或暗示引用的出版物是现有技术。Shanbrom的美国专利第7,297,716号公开了从冷沉淀中分离血液产品(例如，纤维蛋白胶)的方法。Shanbrom的方法使用盐来增加冷沉淀的收率。例如，将重量分数为2-10％的柠檬酸钠加入血液或血浆中。在此浓度下的柠檬酸钠可以灭活和/或抑制致病微生物，防止细胞和蛋白质变性，增加冷沉淀的收率(即使不冷冻)，并有助于去除变性组分。Shanbrom考虑从冷沉淀中分离各种凝血因子，包括纤维蛋白原、因子II、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和血小板。然而，Shanbrom未能认识到盐可以被添加到预先冷冻的血液产品中，达到11％(重量)以上的浓度。此外，Shanbrom也不了解可以从任何上清液中提取蛋白质产品，其中就包括由具有11-13％(重量)和21-23％(重量)盐的中间产物形成的上清液。一种蛋白质产品是α-1-蛋白酶抑制剂(“A1PI”)。A1PI是蛋白酶抑制剂的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的52kDa糖蛋白。通常，A1PI可以保护组织，如肺的弹性组织免受嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的伤害，特别是在炎症部位。A1PI的遗传缺陷可导致肺气肿、慢性阻塞性肺病和肝硬化。如果对A1PI缺陷不进行治疗，可能会引起损伤，而施用A1PI则可以预防这些损伤。Coan的美国专利4,697,003公开了一种从血浆蛋白质水溶液中分离A1PI的方法。Coan的方法建立在Cohn乙醇分馏技术上，该技术包括解冻新鲜冷冻血浆、去除沉淀物，并且将乙醇分五个阶段添加至浓度约40％。Coan方法的第一步是对Cohn液II+III、液I或冷上清液进行脱盐处理。接着，将脱盐溶液与阴离子交换树脂接触，并且A1PI选择性地结合到树脂上。用淋洗液将A1PI置换至洗脱液。最后，从洗脱液中回收A1PI。然而，乙醇和其他醇可能会产生问题，因为它们容易使期望的蛋白质变性，如A1PI。Kumpalume等人的美国专利第8,580,931号还公开了分离A1PI的方法，其包括将A+1上清液经历两个金属螯合层析步骤。借用KistlerNitschmann工艺的术语，A+1上清液为沉淀物A和组分1的组合。然而，A+1上清液的制备还包括加入17-21％(v/v)的乙醇，其可以使如上所述的蛋白质变性。也可参见Thierry的专利DE3874376。在美国专利第7,879,331号、第7,879,332号和第8,293,242号中，专利技术人构想了一种盐析工艺，可在从血液产品中提取蛋白质产品时不使用乙醇。在本专利技术的主题中，专利技术人发现了简化的方法：在盐沉淀步骤之前不需要将冷沉淀与去冷沉淀血浆分离。另外，在第一糊沉淀和第二糊沉淀中保留很少蛋白质产品的情况下，可以不用重新溶解糊沉淀并进行进一步的纯化而保持较高的蛋白质产品收率。至于A1PI，专利技术人发现在22％(重量)的盐浓度下有非常少的A1PI沉淀。鉴于文献教导了A1PI在较高的盐浓度下沉淀，这个结果令人惊讶。由于糊沉淀中很少有A1PI损失，所以可以从第二上清液中获得高收率。因此，工艺可通过除去糊沉淀处理步骤进行改进。将第二上清液施加到亲和柱上可以进行最低限度的预处理(例如生物负载过滤、溶剂/洗涤剂处理、渗滤)，进一步简化蛋白质产品的分离。另一方面，考虑在亲和柱的上游或下游加入内毒素去除步骤。考虑的内毒素去除步骤包括用多粘菌素B或其它亲和介质(例如树脂或膜)处理。本文讨论的这些和所有其他外部资料通过引用并入本文。在并入的参考文献中的术语的定义或使用与本文所提供的该术语的定义不一致或相悖的情况下，在本文中提供的该术语的定义适用，而参考文献中该术语的定义不适用。除非上下文指出相反的情况，否则本文阐述的所有范围应被解释为包括它们的端点，并且开放式范围应被解释为包括商业上可行的值。同样，除非上下文指出相反的情况，否则所有值列表均应视为包含中间值。
技术实现思路
本专利技术主题提供了可以从包含血浆的血液产品生产蛋白质产品的方法。优选的方法包括以下步骤：(1)向血液产品中加入盐以产生第一中间产物，其中盐占该第一中间产物重量的11-20％，(2)分离该第一中间产物以产生第一上清液和第一糊沉淀；(3)向该第一上清液中加入盐以产生第二中间产物，其中盐占该第二中间产物重量的15-30％；(4)分离该第二中间产物以产生第二上清液和第二糊沉淀；(5)通过亲和层析从该第二上清液分离第三中间产物；以及(6)通过离子交换色谱分离该第三中间产物以产生含有蛋白质产品的洗脱液。关于包含血浆的血液产品，本专利技术人考虑原料血浆、新鲜冷冻血浆、回收血浆或回输血浆中的任何一种可用于符合本专利技术主题的方法中。应当理解，尽管本文所述的方法不一定需要将冷冻的含有血浆的产品作为起始材料，但常规的含血浆产品通常是冷冻的，并且在进一步加工或纯化之前通常需要进行解冻。关于添加到血液产品中的盐，可以使用的盐范围很广，包括例如(但不限于)柠檬酸盐、乙酸盐和/或葡萄糖酸盐。合适的盐是水溶性的。尽管优选使用水溶性盐，但不排除使用非水溶性盐(例如柠檬酸钙或其它在水中溶解度低的盐)与改善不溶性盐的溶解度的螯合剂(例如EDTA)。通常，盐含量为10.1-25％(重量)的第一中间产物形成第一沉淀物和第一上清液；更通常地，盐含量为10.1-11％、11-13％、13-15％和15-20％(重量)。有时，可以通过将pH调节至3-10范围内的特定值和/或通过将混合物的温度调节至0-25℃范围内的特定值来改善蛋白质分离。应当理解，可通过离心或过滤来分离第一中间产物以产生第一上清液和第一糊沉淀。当使用离心时，第一沉淀物形成沉淀球(即第一糊沉淀)，第一上清液可以从中倾出、移除或除去。在更大规模的工艺下，过滤优于离心。当使用过滤时，第一上清液为滤液并且第一沉淀物形成滤饼(即第一糊沉淀)。关于第二上清液，通常考虑盐含量为15-30％(重量)，更通常为15-21％、21-23％、23-25％、25-27％和27-30％(重量)。由于盐被加入到第一上清液中，第二中间产物的盐含量将大于第一中间产物的盐含量。通过将pH调节至3-10的特定值和/或通过将混合物的温度调节至0-25℃的特定值可以改善蛋白质分离。在分离第一上清液和第一沉淀物时的考虑因素同样适用于第二上清液与第二沉淀物的分离。在本专利技术方法的一个示例性实施方案中，在将第二上清液进行亲和层析之前，可以对第二上清液进行过滤以去除生物负载，用溶剂和洗涤剂处理以灭活第二上清液中的包膜病毒，和/或进行脱盐处理(例如通过渗滤和/或超滤)。如本文所用，渗滤意指用于交换含蛋白质产品的溶液/缓冲液的过滤。如本文所用，超滤是浓缩蛋白质产品溶液的过滤过程。对于渗滤和超滤，垂直和切向流型均可考虑。渗滤和/或超滤可较好地除去盐和低分子量物质。在另一个示例性实施方案中，在通过亲和层析从第二上清液分离第三中间产物的步骤中使用合适的亲和树脂。亲和树脂可以从诸如Bio-Rad、Sigma-Aldri本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从含血浆产品生产蛋白质产品的方法，所述方法包括：向含血浆产品中加入盐以产生第一中间产物，其中盐占所述第一中间产物重量的11‑20％；分离所述第一中间产物以产生第一上清液和第一糊沉淀；向所述第一上清液中加入盐以产生第二中间产物，其中盐占所述第二中间产物重量的15‑30％；分离所述第二中间产物以产生第二上清液和第二糊沉淀；通过亲和层析从所述第二上清液分离第三中间产物；以及通过离子交换色谱分离所述第三中间产物以产生含蛋白质产品的洗脱液。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.15 US 62/242,1651.一种从含血浆产品生产蛋白质产品的方法，所述方法包括：向含血浆产品中加入盐以产生第一中间产物，其中盐占所述第一中间产物重量的11-20％；分离所述第一中间产物以产生第一上清液和第一糊沉淀；向所述第一上清液中加入盐以产生第二中间产物，其中盐占所述第二中间产物重量的15-30％；分离所述第二中间产物以产生第二上清液和第二糊沉淀；通过亲和层析从所述第二上清液分离第三中间产物；以及通过离子交换色谱分离所述第三中间产物以产生含蛋白质产品的洗脱液。2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：在将盐加入所述含血浆产品中以产生第一中间产物之前，将所述含血浆产品解冻并搅拌。3.如权利要求1所述的方法，其中将盐加入所述含血浆产品的步骤包括：加入一定量的第一盐，所述第一盐选自柠檬酸盐、乙酸盐和葡萄糖酸盐。4.如权利要求1所述的方法，其中分离所述第一中间产物以产生第一上清液和第一糊沉淀的步骤包括：离心所述第一中间产物。5.如权利要求1所述的方法，其中分离所述第一中间产物以产生第一上清液和第一糊沉淀的步骤包括：过滤所述第一中间产物。6.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：在分离步骤之前使所述第二上清液脱盐。7.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：在通过亲和层析纯化所述第二上清液的步骤之前，灭活所述第二上清液中的任何包膜病毒。8.如权利要求7所述的方法，其中使第二上清液中的任何包膜病毒失活的步骤包括：用足以使所述包膜病毒失活的量的溶剂和洗涤剂处理第二上清液。9.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：在通过亲和层析纯化所述第二上清液的步骤之前使所述第二上清液脱盐。10.如权利要求9所述的方法，其中所述第二上清液的脱盐步骤包括使用超滤膜过滤所述第二上清液。11.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：无菌过滤所述洗脱液。12.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质产品包含α-1-蛋白酶抑制剂、γ-球蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、因子VIII、因子IX、因子XIII、蛋白C、抗凝血酶III、纤维蛋白原和C1酯酶抑制剂中的至少一种。13.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：从所述第一糊沉淀和所述第二糊沉淀中的至少一种分离第二蛋白质产品。14.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：从根据亲和层析从第二上清液分离第三中间产物的步骤产生的流穿液和洗涤液中的至少一种中分离第二蛋白质产品。15.如权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述第二蛋白质产品不同于所述第一蛋白质产品并且包含α...

【专利技术属性】
技术研发人员：尤金·祖洛，丹尼斯·柯廷，查尔斯·海尔德布兰特，大卫·彼得·诺万廷克，
申请(专利权)人：普莱泽玛科技有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US