高油酸转基因大豆事件E2D8037-3外源插入片段侧翼序列及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种高油酸转基因大豆事件E2D8037‑3外源插入片段侧翼序列及其应用，属于植物生物技术领域。具体地，涉及一种高油酸转基因大豆事件E2D8037‑3外源插入片段左、右边界侧翼序列及其应用。本发明专利技术公开的转基因大豆事件E2D8037‑3外源插入片段左边界侧翼序列如SEQ‑2所示，右边界侧翼序列如SEQ‑3所示。本发明专利技术公开的转基因大豆事件E2D8037‑3外源插入片段侧翼序列可以用作目标DNA序列，建立该转基因事件特异性检测方法。本发明专利技术提供的外源插入片段侧翼序列及检测方法适用于对该转基因大豆事件包括亲本、衍生品系或品种，及其制品包括植株、组织、种子及产品的特异性检测。

【技术实现步骤摘要】
高油酸转基因大豆事件E2D8037-3外源插入片段侧翼序列及其应用
本专利技术涉及植物生物
，具体地，涉及一种高油酸转基因大豆事件E2D8037-3外源插入片段侧翼序列及其应用。
技术介绍
油酸是一类广泛存在于多种油料作物(如大豆、油菜、花生等)籽粒中的不饱和脂肪酸。研究表明，油酸具有重要的营养和保健功能。油酸能够降低人体血液中胆固醇的含量，减少其在血管上的沉积，有软化血管、预防动脉硬化等作用。营养界一般把油酸称为“安全脂肪酸”，油酸的含量多少，是评定食用油品质的重要标志。另外，由于脂肪酸不饱和程度较低，高比例的油酸可以有效提高食用油的稳定性。大豆种子油酸的含量一般为20～25％，而不饱和程度较高的亚油酸和亚麻酸比例则高达60％以上。尽管亚油酸被认为是一种重要的脂肪酸，而且对降低血液中胆固醇水平有一定作用，但富含亚油酸的植物油是高度不稳定的，当其暴露在空气中或烹调时产生的高温很容易发生过氧化作用，产生一些对健康有害的氧化产物，并伴有难闻的气味。同时在加工过程中易产生对人体有害的反式脂肪酸。与之相反的是，油酸是一种单价不饱和脂肪酸，其稳定性高，富含油酸的食用油可用于长时间的保存和高温烹调而不易氧化变质。再加上油酸本身所具有的营养和保健功能，使得油酸含量的多少在很大程度上决定了大豆优油脂的品质。因此，提高大豆油酸含量，培育高油酸大豆品种，对于提升大豆品质具有重要的意义。在种子发育过程中，质体中的脂肪酸合成酶复合物催化乙酰CoA合成脂肪酸，并进入细胞质中合成三酯酰甘油。作为LA合成的前体，OA是多不饱和脂肪酸合成途径中最关键的步骤。Δ12-脂肪酸脱饱和酶(delta-twelvefattyaciddesaturase2enzyme，FAD2，EC1.3.1.35)是催化这一生化过程的关键酶，决定种子中多不饱和脂肪酸的含量。已有研究表明，抑制或过表达FAD2-1基因，可以显著改变油酸/亚油酸比例。Pham等研究发现，FAD2-1A和FAD2-1B双突变体大豆的油酸含量极显著提高(80％)。Zhang等通过反义RNA介导转录后基因沉默抑制大豆内源FAD2基因的表达，获得了油酸含量高达51.71％的转基因大豆。Wang等利用RNAi技术抑制大豆FAD2基因，获得了油酸含量为71.5％-81.9％的大豆品系。Haun等利用人工核酶技术(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALEN)对大豆内源FAD2-1A和FAD2-1B进行定点突变，获得了油酸含量达80％的转基因大豆。吉林省农业科学院采用农杆菌介导法将大豆RNAiGmFAD2-1B基因导入大豆栽培品种Williams82，获得高油酸转基因大豆.E2D8037-3。连续多代脂肪酸组分分析表明，转基因大豆E2D8037-3油酸含量达77.11％，显著高于受体对照品种Williams82(油酸含量为17.81-22.0％)，提高2倍以上。另外，E2D8037-3亚油酸含量比对照降低50％左右，饱和脂肪酸-棕榈酸和硬脂酸降低至10.0％左右，其脂肪酸组成接近于橄榄油(油酸含量70～80％)。目前高油酸转基因大豆事件E2D8037-3已进入安全评价阶段，随着国家转基因生物新品种培育重大专项的推进，该转化事件及其衍生品种或品系有望进入商业化应用。对转基因事件及其衍生品系或品种特异性检测，是实现转基因植物有效监督管理，保障转基因产业健康发展的重要技术手段。外源插入片段的侧翼序列和根据此侧翼序列建立的检测方法，是对转基因植物及其产品进行有效监督管理的一个重要依据。目前已经有相关专利和文献报道了转基因植物外源插入侧翼序列。张大兵等(2006)利用TAIL-PCR方法分析了玉米品系MON863的外源插入片段的侧翼序列，建立了转基因MON863玉米的品系特异性检测方法。谢家建等(2007)利用TAIL-PCR、genomewalking和LD-PCR等方法获得了转基因水稻克螟稻、Bt汕优863和科丰6号的外源插入片段的侧翼序列，杨正友等(2012)利用TAIL-PCR方法建立了转基因水稻品系SK-2的外源插入片段的侧翼序列，并建立了该品系特异性的检测方法。对现有专利和文献进行分析，目前尚未发现高油酸转基因大豆事件E2D8037-3外源插入片段侧翼序列相关的文章和专利报道。本研究通过基因组重测序技术和PCR技术，获得转基因大豆事件E2D8037-3外源插入片段左、右边界侧翼序列，并依据其序列特征，建立该转化事件特异性检测方法，为高油酸转基因大豆事件E2D8037-3及其衍生品种或品系的商业化应用提供依据。在此基础上，提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供高油酸转基因大豆事件E2D8037-3外源插入片段左、右边界侧翼序列。本专利技术还提供该转基因事件的特异性检测方法。本专利技术通过如下技术方案实现：本专利技术提供的转基因大豆事件E2D8037-3外源插入片段左、右边界侧翼序列如SEQ-2和SEQ-3所示，其特征在于，由来源于大豆基因组序列和来源于外源插入片段序列组成的DNA序列。其中：外源插入片段左边界侧翼序列特征包括：(1)SEQ-2第1-213位点序列来源于栽培大豆Williams82基因组序列；(2)SEQ-2第214-895位点序列来源于外源插入片段序列。外源插入片段右边界侧翼序列特征包括：(1)SEQ-3第1-615位点序列来源于外源插入片段序列；(2)SEQ-3第616-998位点序列来源于栽培大豆Williams82基因组序列。本专利技术提供的转基因大豆事件E2D8037-3外源插入片段左边界和右边界侧翼序列通过如下方式获得：(1)以高油酸转基因大豆事件E2D8037-3为材料，采用基因组重测序技术，并检索大豆基因组数据库(http://soybase.org/)，确定外源片段在参考大豆基因组(Wm82.a2.v1)中的具体插入位置为Chr15染色体的45341084位点，插入方式为单位点双拷贝插入。并获得插入位点在参考大豆基因组上游和下游～2kb序列，如SEQ-1所示。(2)根据参考大豆基因组中外源片段上游和下游序列及插入片段序列设计引物，以E2D8037-3基因组总DNA为模板进行PCR扩增，获得转基因大豆事件E2D8037-3外源插入片段左、右边界侧翼序列如SEQ-2和SEQ-3所示。所述序列由来源于大豆基因组序列和来源于外源插入片段序列组成的DNA序列。鉴于转基因事件中外源片段在植物基因组中的整合具有随机性的特点，不同转基因事件其外源片段在基因组中的插入位点不同。对于特定的转基因事件来说，其侧翼序列是特异的。因此，利用插入片段侧翼序列可以对转基因事件进行特异性检测。如利用包含部分侧翼序列和部分外源插入片段序列的探针进行杂交，或是设计包含部分侧翼序列和部分外源插入片段序列的特异性引物进行PCR扩增等。本专利技术提供的转基因大豆事件E2D8037-3特异性检测方法或检测试剂盒，其特征在于，利用转基因大豆事件E2D8037-3外源插入片段左边界侧翼序列，设计特异性检测引物或制备特异性探针。其中一条引物为依据SEQ-2第1-213位点序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ-2第214-895位点序列设计的反向引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.高油酸转基因大豆事件E2D8037‑3外源插入片段左边界和右边界侧翼序列如SEQ‑2和SEQ‑3所示，其特征在于，由来源于大豆基因组序列和来源于外源插入片段序列组成的DNA序列；其中：外源插入片段左边界侧翼序列特征包括：(1)SEQ‑2第1‑213位点序列来源于栽培大豆Williams82基因组序列；(2)SEQ‑2第214‑895位点序列来源于外源插入片段序列；外源插入片段右边界侧翼序列特征包括：(1)SEQ‑3第1‑615位点序列来源于外源插入片段序列；(2)SEQ‑3第616‑998位点序列来源于栽培大豆Williams82基因组序列。

【技术特征摘要】
1.高油酸转基因大豆事件E2D8037-3外源插入片段左边界和右边界侧翼序列如SEQ-2和SEQ-3所示，其特征在于，由来源于大豆基因组序列和来源于外源插入片段序列组成的DNA序列；其中：外源插入片段左边界侧翼序列特征包括：(1)SEQ-2第1-213位点序列来源于栽培大豆Williams82基因组序列；(2)SEQ-2第214-895位点序列来源于外源插入片段序列；外源插入片段右边界侧翼序列特征包括：(1)SEQ-3第1-615位点序列来源于外源插入片段序列；(2)SEQ-3第616-998位点序列来源于栽培大豆Williams82基因组序列。2.权利要求1所述外源插入片段左、右边界侧翼序列的制备方法，其特征在于，提取转基因大豆事件E2D8037-3基因组DNA，利用基因组重测序技术分析确定外源片段插入位点，并通过PCR扩增获得。3.权利要求书1所示序列在建立转基因大豆事件E2D8037-3特异性检测方法或制备检测试剂盒中的应用，其特征在于，依据权利要求书1所示序列，制备特异性引物或探针。4.权利要求1所述序列、权利要求书3所述特异性检测方法或检测试剂盒在转基因大豆事件E2D8037-3包括亲本、衍生品系或品种，及其制品包括植株、组织、种子及产品检测中的应用。5.权利要求3、...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨向东，仲晓芳，杨静，赵倩倩，杜娟，牛陆，邢国杰，贺红利，郭东全，钱雪燕，姚瑶，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：吉林,22