一种生物分子的电化学检测方法技术

本发明专利技术公开一种生物分子的电化学检测方法，属于生物分子检测技术领域。所述方法首先合成出具有电活性的二茂铁酪胺分子，然后通过还原法制备出石墨烯/血红素复合纳米材料，所述材料在H2O2的存在下能触发二茂铁修饰酪氨在电极表面的催化沉积反应，导致具有电活性的二茂铁分子在电极表面大量聚集，而产生增强的氧化还原电流。在生物分子检测过程中，检测到的氧化还原电流与生物分子的量在一定范围内成线性关系。通过电化学工作站检测所产生的氧化还原电流的大小，即可实现对生物分子的电化学检测。本发明专利技术建立的生物分子的电化学检测方法具有灵敏、操作简单、检测时间短等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种生物分子的电化学检测方法
本专利技术属于生物分子检测
，具体涉及一种基于石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料电化学高灵敏检测p53等蛋白的方法。
技术介绍
电化学生物传感技术是采用固体电极作基础电极，将生物敏感分子固定在电极表面，然后通过生物分子间的特异性识别作用，生物敏感分子能选择性地识别目标分子并将目标分子捕获到电极表面，基础电极作为信号传导器将电极表面发生的识别反应信号导出，变成可以测量的电信号，从面实现对分析目标物进行定量或定性分析的目的，其由于所需仪器简单、选择性好、分析速度快、检测成本低、易于实现微型化等优点，在生物医学、环境监测、食品和医药等领域具有广泛的应用前景。基于HRP酶催化酪胺沉积的信号放大技术，其主要原理是辣根过氧化物酶（HRP）H2O2存在下催化酪胺盐，形成共价键结合位点，在15min内大量的标记物沉积在要放大的信号位点上，使原始信号得到几何级的放大。生物酶是从生物体中产生的，具有特殊的催化功能的蛋白质，由氨基酸长链组成。在受到紫外线、热、射线、表面活性剂、金属盐、强酸、强碱及其它化学试剂如氧化剂、还原剂等因素影响时，酶蛋白的二级、三级结构有所改变，使其酶活性降低，甚至失活。本专利技术利用基于纳米材料的拟酶代替生物酶，开发了一种利用基于石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料催化二茂铁酪胺沉积信号放大原理的电化学生物传感技术，用于生物分子的高灵敏检测。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种二茂铁酪胺电活性物质及制备方法，并利用该物质来对生物分子进行电化学检测。为实现本专利技术目的所使用的技术方案为：一种生物分子的电化学检测方法，包括制备石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料、制备二茂铁酪胺、制备适配体功能化复合材料、电极修饰和生物分子检测；所述制备石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料的步骤为：按质量比为1:15的比例分别称取石墨烯和血红素后，将石墨烯配置成石墨烯溶液，将血红素配置成血红素溶液，将两份溶液混合后，加入NH2-NH2，涡旋10-15min后，60-65℃水浴3-5h，15000-20000r/min离心25-35min，所得沉淀用超纯水洗涤，冻干，即得到石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料；所述制备二茂铁酪胺的步骤为：取二茂铁甲酸于无水CH2Cl2溶解，0ºC下缓缓滴加Et3N，再依次加入HBTU和HOBt，0ºC反应10-15h，溶液由黄色变为红色，旋转蒸干，层析纯化，得到红褐色活化物，将其溶于THF后，取酪胺溶于硼酸缓冲溶液，0ºC混合上述两种溶液并调pH至9-10，反应8-10h后，室温反应20-24h，旋转蒸发除去THF，余下水相用EtOAc萃取一次后，将水相调pH至1-2，EtOAc再次萃取；将所得两次萃取液合并，过滤、无水Na2SO4除水、再次过滤后旋转蒸发，所得产物用展开剂溶解，柱层析进行纯化，最后于35-40ºC水浴锅中干燥即可得到二茂铁酪胺；所述制备适配体功能化复合材料的步骤为：将石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料与核酸链混合均匀，超声10-15min后室温孵育24h，缓慢加入NaCl溶液；13000-15000r/min离心30-40min取上清，洗涤3次后，重新分散在Tris-EDTA缓冲液中，去除游离的适配体，即得适配体功能化复合材料；所述电极修饰的步骤为：将巯基丙酸与DNA1链合滴到处理好的金电极表面，0-4ºC自组装10-12h，PBS洗涤3次，用EDC/NHS室温活化30min，PBS洗涤3次后，将电极浸泡在10mM酪胺溶液30min，用PBS洗涤3次，用1%BSA封闭非特异性位点，PBS洗涤3次，得修饰电极；所述生物分子检测的步骤为：将修饰电极表面滴加生物分子、生物识别分子及石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料，35-37ºC孵育1-2h后，PBS洗涤3次，最后在电极表面滴加酪胺、二茂铁酪胺、H2O2，50-55ºC水浴30min，用PBS洗3次；以金电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在NaClO4电解液中利用电化学工作站进行DPV扫描，扫描范围-0.2~0.6V，扫描速率100-150mV/s，通过电化学工作站检测到的氧化还原电流的大小，即可实现对电化学检测。优选的，所述制备石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料的步骤中，所述石墨烯溶液配置方法为将石墨烯用适量超纯水超声分散均匀，3000-4000r/min10-15min离心,取其上清液，即得；所述血红素溶液配置方法为将血红素用适量超纯水分散均匀后,加入NH3·H2O，所述添加是超纯水和NH3·H2O体积比为1000：5-20。优选的，所述制备二茂铁酪胺的步骤中，所述层析纯化使用的试剂为二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇，其比例为二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇=9:3:1，所述的展开剂为二氯甲烷、甲醇，其比例为二氯甲烷:甲醇=10:1。优选的，所述制备二茂铁酪胺的步骤中，所述的酪胺溶于硼酸缓冲溶液的时间为12-14h，pH值为2-4。优选的，所述制备适配体功能化复合材料的步骤中，加入NaCl溶液至终浓度10mM。优选的，所述电极修饰的步骤中，所述DNA1链为P1和P4杂交链，所述的P1：TTTTTTTTTTGCATCGGTCACAGACA，所述的P4：TGTCTAGGCATGTCTGTGACCGATGC。优选的，所述电极修饰的步骤中，所述EDC/NHS的浓度为10mM。优选的，所述生物分子检测的步骤中，所述生物分子包括蛋白质、核酸、细胞，所述的生物识别分子包括抗体、适配体、核酸；特别的，所述的生物识别分子为DNA2，所述的DNA2由P2与P3杂交，所述的P2：TGCCTAGACATGCCTTGCAGTCTCGA，P3：GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATTTTTCGAGACTGCAAGGCA。优选的，所述巯基丙酸与生物分子的比例为3:1。优选的，所述的生物分子为p53蛋白。本专利技术突出的实质性进步和显著的特点是：1.石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料具有催化H2O2的作用，且具有高效的的电子传递性能、大的比表面积、与单链DNA碱基π-π作用紧密结合等优点，使得石墨烯血红素复合纳米材料能够快速应用到传感器中。2.二茂铁酪胺是一种高效的电活性物质，同时可以利用酪胺盐的催化信号放大原理大量沉积目标物。3.通过碱基互补配对及抗原抗体的特异性识别原理，可有效提高检测生物分子（蛋白质、核酸、细胞）的特性性和灵敏性。4.在催化沉积过程中利用石墨烯/血红类过氧化酶素复合纳米材料在H2O2存在下催化Fc-Tyr（二茂铁酪胺），形成共价键结合位点，使大量的二茂铁酪胺沉积，信号得到几何级的放大，可有效提高生物分子（蛋白质、核酸、细胞）的检测限。5.本专利技术的检测过程安全、简单、快速，为以后的便携式实时检测提供了思路。附图说明图1基于石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料电化学高灵敏检测p53蛋白的方法原理图。图2石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料紫外表征图。图3二茂铁酪胺核磁共振氢谱表征图。图4二茂铁酪胺催化H2O2沉积反应图。图5基于石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料电化学高灵敏检测p53蛋白的方法对不同浓度p53蛋白的响应曲线。具体实施方式下面结合实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物分子的电化学检测方法，其特征在于，包括制备石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料、制备二茂铁酪胺、制备适配体功能化复合材料、电极修饰和生物分子检测；所述制备石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料的步骤为：按质量比为1:15的比例分别称取石墨烯和血红素后，将石墨烯配置成石墨烯溶液，将血红素配置成血红素溶液，将两份溶液混合后，加入NH2‑NH2，涡旋10‑15 min后，60‑65℃水浴3‑5 h，15000‑20000 r/min离心25‑35 min，所得沉淀用超纯水洗涤，冻干，即得到石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料；所述制备二茂铁酪胺的步骤为：取二茂铁甲酸于无水CH2Cl2溶解，0ºC下缓缓滴加Et3N，再依次加入HBTU和HOBt，0ºC反应10‑15 h，溶液由黄色变为红色，旋转蒸干，层析纯化，得到红褐色活化物，将其溶于THF后，取酪胺溶于硼酸缓冲溶液，0ºC混合上述两种溶液并调pH至9‑10，反应8‑10 h后，室温反应20‑24 h，旋转蒸发除去THF，余下水相用EtOAc萃取一次后，将水相调pH至1‑2，EtOAc再次萃取；将所得两次萃取液合并，过滤、无水Na2SO4除水、再次过滤后旋转蒸发，所得产物用展开剂溶解，柱层析进行纯化，最后于35‑40ºC水浴锅中干燥即可得到二茂铁酪胺；所述制备适配体功能化复合材料的步骤为：将石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料与核酸链混合均匀，超声10‑15min后室温孵育24h，缓慢加入NaCl溶液；13000‑15000 r/min离心30‑40min取上清，洗涤3次后，重新分散在Tris‑EDTA缓冲液中，去除游离的适配体，即得适配体功能化复合材料；所述电极修饰的步骤为：将巯基丙酸与DNA1链合滴到处理好的金电极表面，0‑4ºC自组装10‑12h，PBS洗涤3次，用EDC/NHS室温活化30 min，PBS洗涤3次后，将电极浸泡在10 mM酪胺溶液30 min，用PBS洗涤3次，用1% BSA封闭非特异性位点，PBS洗涤3次，得修饰电极；所述生物分子检测的步骤为：将修饰电极表面滴加生物分子、生物识别分子及石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料，35‑37ºC孵育1 ‑2h后，PBS洗涤3次，最后在电极表面滴加酪胺、二茂铁酪胺、H2O2，50‑55ºC水浴30 min ，用PBS洗3次；以金电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在NaClO4电解液中利用电化学工作站进行DPV扫描，扫描范围‑0.2~0.6V，扫描速率100‑150 mV/s，通过电化学工作站检测到的氧化还原电流的大小，即可实现对电化学检测。...

【技术特征摘要】
1.一种生物分子的电化学检测方法，其特征在于，包括制备石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料、制备二茂铁酪胺、制备适配体功能化复合材料、电极修饰和生物分子检测；所述制备石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料的步骤为：按质量比为1:15的比例分别称取石墨烯和血红素后，将石墨烯配置成石墨烯溶液，将血红素配置成血红素溶液，将两份溶液混合后，加入NH2-NH2，涡旋10-15min后，60-65℃水浴3-5h，15000-20000r/min离心25-35min，所得沉淀用超纯水洗涤，冻干，即得到石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料；所述制备二茂铁酪胺的步骤为：取二茂铁甲酸于无水CH2Cl2溶解，0ºC下缓缓滴加Et3N，再依次加入HBTU和HOBt，0ºC反应10-15h，溶液由黄色变为红色，旋转蒸干，层析纯化，得到红褐色活化物，将其溶于THF后，取酪胺溶于硼酸缓冲溶液，0ºC混合上述两种溶液并调pH至9-10，反应8-10h后，室温反应20-24h，旋转蒸发除去THF，余下水相用EtOAc萃取一次后，将水相调pH至1-2，EtOAc再次萃取；将所得两次萃取液合并，过滤、无水Na2SO4除水、再次过滤后旋转蒸发，所得产物用展开剂溶解，柱层析进行纯化，最后于35-40ºC水浴锅中干燥即可得到二茂铁酪胺；所述制备适配体功能化复合材料的步骤为：将石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料与核酸链混合均匀，超声10-15min后室温孵育24h，缓慢加入NaCl溶液；13000-15000r/min离心30-40min取上清，洗涤3次后，重新分散在Tris-EDTA缓冲液中，去除游离的适配体，即得适配体功能化复合材料；所述电极修饰的步骤为：将巯基丙酸与DNA1链合滴到处理好的金电极表面，0-4ºC自组装10-12h，PBS洗涤3次，用EDC/NHS室温活化30min，PBS洗涤3次后，将电极浸泡在10mM酪胺溶液30min，用PBS洗涤3次，用1%BSA封闭非特异性位点，PBS洗涤3次，得修饰电极；所述生物分子检测的步骤为：将修饰电极表面滴加生物分子、生物识别分子及石墨烯/血红素类过氧化酶复合纳米材料，35-37ºC孵育1-2h后，PBS洗涤3次，最后在电极表面滴加酪胺、二茂铁酪胺、H2O2，50-55ºC水浴30min，用PBS洗3次；以金电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在NaClO4电解液中利用...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵永祥，黄勇，钟莉娉，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西,45