本发明专利技术公开一种基于NiCo2O4纳米片状材料及肽链切割效应的胰蛋白酶电化学传感平台的构建。利用NiCo2O4纳米片状材料作为电活性基底材料，通过将纳米石墨相氮化碳标记肽(g‑C3N4@petide)对基底材料的信号放大作用，制备一种电化学传感器并应用于胰蛋白酶的检测。基于NiCo2O4纳米片状材料的稳定性及优良导电性使其能加快电子的转移速度并提高电流信号，而g‑C3N4及肽链的引入，将起到空间阻碍作用，明显降低电流信号。当该传感界面在胰蛋白酶溶液中孵化，胰蛋白酶可以催化水解肽键，起到对于肽链的切割效应，使g‑C3N4@petide从电极表面释放，从而提高电流信号。该方法用来监测胰蛋白浓度及可进一步应用于其抑制剂筛选。
【技术实现步骤摘要】
一种基于NiCo2O4纳米片状材料及肽链切割效应的胰蛋白酶电化学传感平台的构建
本专利技术属于新型功能材料与生物传感检测
，具体涉及一种基于NiCo2O4纳米片状材料及肽链切割效应的胰蛋白酶电化学传感平台的构建。
技术介绍
近年来，在医疗诊断和病原体识别中利用高效的生物传感器的构建实现简单的蛋白质检测得到越来越广泛的关注。预测及诊断癌症以能够早期干预和更好的管理疾病，作为诊断工具，肿瘤标志物发挥了重要的作用。胰蛋白酶是一种由胰腺产生重要的消化酶，其控制胰腺外分泌功能。此外，大量的疾病与胰蛋白酶的浓度水平变化密切相关，例如，囊性纤维化，胰腺炎，坏疽，和胎粪性肠梗阻。因此，发展一种简便有效的胰蛋白酶生物测定及对其抑制剂的监测的方法有着重要的治疗意义。目前，检测胰蛋白酶的生物测定方法主要有酶联免疫吸附试验、电化学和荧光光谱等。然而，这些方法的灵敏度的进一步增强及探索一个低背景信号，重现性好，宽的响应范围的传感平台仍然是胰蛋白酶测定的迫切要求。电化学检测，是基于电化学过程和化学/生物识别过程建立起来的一种新的分析方法。该方法以[Ru(NH3)6]3+作为信号源，以电流作为检测信号，具有灵敏度高、响应快速、设备简单和易微型化等优点，为临床诊断、环境监测与食品安全等领域提供了一种强有力手段。电化学分析检测的是电信号，通过采用不同形式的能量作为激发信号和检测信号，使激发和检测信号互不干扰，因而背景信号较低，可获得较高的灵敏度。电材料的类型、性能与电化学过程的实现有着直接且紧密的关系，电材料本身的电化学性质、制备方法、复合效果、形貌控制、电荷传导速率等对于电化学过程的顺利实现有重要影响。NiCo2O4纳米材料因其具有良好的电催化活性、导电性、生物兼容性、无毒性，环境友好等特点，使其成为电化学传感器的理想材料。NiCo2O4纳米片状材料的性能一般受纳米结构等的影响。NiCo2O4超级结构是纳米层状结构，相比于其他的NiCo2O4纳米结构，NiCo2O4超级结构不仅可以提高电解质和电极材料的连接效率，而且可以提高电极内部和电极与电解质溶液界面处的离子和电子转移速率，进而进一步提高NiCo2O4的导电性。本专利技术提供了一种针对胰蛋白酶的电化学检测新方法。该方法利用NiCo2O4纳米片状材料作为电活性基底材料，通过将纳米石墨相氮化碳标记肽(g-C3N4@petide)对基底材料的信号放大作用，制备一种电化学传感器并应用于胰蛋白酶的检测。基于NiCo2O4纳米片状材料的稳定性及优良导电性使其能加快电子的转移速度并提高电流信号，而g-C3N4及肽链的引入将明显的降低电流信号，当该传感界面在胰蛋白酶溶液中孵化，胰蛋白酶可以催化水解肽键，起到对于肽链的切割效应，使g-C3N4@petide从电极表面释放，从而提高电流信号。该传感界面的电流信号与胰蛋白酶浓度在1×10-10mg/mL–10-4mg/mL范围内呈线性。该方法可以用来监测不同的疾病过程中的胰蛋白浓度及可进一步应用于其抑制剂筛选。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是基于NiCo2O4纳米片状材料及肽链切割效应的胰蛋白酶电化学传感平台的构建。本专利技术的目的之二是将该电化学传感器应用于胰蛋白酶的高灵敏检测。为实现专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：(1)GCE的预处理：GCE首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；(2)NiCo2O4/PAMAM/peptide@g-C3N4修饰电极的制备：滴加4μL浓度为5mg/mlNiCo2O4和0.3%PAMAM悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温；将电极浸入g-C3N4标记的肽溶液中60min，室温条件下晾干，即将标记肽修饰到电极表面；将修饰电极浸入5μL浓度为1.0wt.%的BSA50min，封闭电极表面上非特异性活性位点,用超纯水冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，制得NiCo2O4/PAMAM/peptide@g-C3N4修饰电极；(3)胰蛋白酶的检测：采用三电极体系进行测定，以NiCo2O4/PAMAM/peptide@g-C3N4修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，利用电化学工作站进行检测，在pH7.4的PBS缓冲溶液中，通过电化学工作站进行检测1×10-10mg/mL–10-4mg/mL一系列不同溶度的胰蛋白酶标准溶液，通过记录加入胰蛋白酶溶液前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替胰蛋白酶标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。本专利技术所用的生物肽为含精氨酸的肽(CAGRAAADAD)，其氨基酸序列表为Cys-Ala-Gly-Arg-Ala-Ala-Ala-Asp-Ala-Asp，购买于karelay生化公司。上述NiCo2O4纳米片状材料的制备：1mmol的Ni(NO3)2·6H2O,2mmol的Co(NO3)2·6H2O和4.5mmol的六亚甲基四胺溶解于含20mL乙醇和40mL去离子水中，然后转移入100mL的聚四乙烯反应釜中，溶液在90℃下用磁力搅拌器搅拌24h，然后冷却至室温，离心得到沉淀并用去离子水和乙醇洗涤数次，产物在60℃条件下干燥12小时并在350℃下煅烧2h，以除去残余的有机物，制得NiCo2O4纳米片状材料。上述g-C3N4@petide溶液的制备：1）石墨相氮化碳(g-C3N4)的制备：双氰胺在550℃的静态空气中以2.3°C/min的缓变率加热4h；冷却速度保持在1°C/min，形成的黄色附聚物在研钵中研成粉末，将该粉末放入一开放陶瓷容器中并在550℃以5°C/min的缓变率加热2h，获得g-C3N4纳米层；2）g-C3N4@petide溶液的制备：10mg的3,4,9,10-苯四甲酸（PTCA）加入1mL蒸馏水中，搅拌后与1mgmL-1g-C3N4混合，在4℃下放置一夜，离心超滤数次并将获得的沉淀重新分散在超纯水中；将20mMEDC和NHS加入g-C3N4.功能化PTCA的溶液中；随后，将溶于10mL绝对乙醇的1mgmL-1肽链加入混合溶液并在4℃下放置一夜。在这一过程中，石墨相氮化碳与3,4,9,10-苯四甲酸π-π共轭相联，3,4,9,10-苯四甲酸的胺基（-NH2）又与生物肽的羧基(-COOH)之间经典的EDC和NHS偶联反应得到石墨相氮化碳标记肽。最后，所制备的石墨相氮化碳标记肽离心洗涤数次后重新分散到100μLpH7.4的磷酸缓冲溶液中。(4)本专利技术所述的一种基于NiCo2O4纳米片状材料及肽链切割效应的胰蛋白酶电化学传感平台，包括工作电极、铂丝电极为对电极和Ag/AgCl为参比电极，其特征在于，所述的工作电极采用NiCo2O4/PAMAM/peptide@g-C3N4修饰电极，其由下述步骤的方法制备而成的，1）玻碳电极的抛光：玻碳电极首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；2）NiCo2O4/PAMAM/peptide@g-C3N4修饰电极的制备：滴加4μL浓度为5mg/mlNiCo2O4和0.3%PAMAM悬浮液于干净的玻本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于NiCo2O4纳米片状材料及肽链切割效应的胰蛋白酶电化学传感平台的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）玻碳电极（GCE）的预处理：GCE首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；（2）NiCo2O4/PAMAM/ peptide@g‑C3N4修饰电极的制备：滴加4μL浓度为5mg/ml NiCo2O4和0.3wt% PAMAM悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温；将电极浸入peptide@g‑C3N4溶液中60 min，室温条件下晾干，即将peptide@g‑C3N4修饰到电极表面；将此修饰电极浸入5μL 浓度为1.0 wt.%的BSA 50 min，封闭电极表面上非特异性活性位点，用超纯水冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，制得NiCo2O4/PAMAM/ peptide@g‑C3N4修饰电极；（3）胰蛋白酶的检测：采用三电极体系进行测定，以NiCo2O4/PAMAM/ peptide@g‑C3N4修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，利用电化学工作站进行检测，在pH 7.4的 PBS缓冲溶液中，通过电化学工作站进行检测1×10‑10 mg/mL–10‑4 mg/mL一系列不同溶度的胰蛋白酶标准溶液，通过记录加入胰蛋白酶溶液前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替胰蛋白酶标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。...
【技术特征摘要】
1.一种基于NiCo2O4纳米片状材料及肽链切割效应的胰蛋白酶电化学传感平台的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）玻碳电极（GCE）的预处理：GCE首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；（2）NiCo2O4/PAMAM/peptide@g-C3N4修饰电极的制备：滴加4μL浓度为5mg/mlNiCo2O4和0.3wt%PAMAM悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温；将电极浸入peptide@g-C3N4溶液中60min，室温条件下晾干，即将peptide@g-C3N4修饰到电极表面；将此修饰电极浸入5μL浓度为1.0wt.%的BSA50min，封闭电极表面上非特异性活性位点，用超纯水冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，制得NiCo2O4/PAMAM/peptide@g-C3N4修饰电极；（3）胰蛋白酶的检测：采用三电极体系进行测定，以NiCo2O4/PAMAM/peptide@g-C3N4修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，利用电化学工作站进行检测，在pH7.4的PBS缓冲溶液中，通过电化学工作站进行检测1×10-10mg/mL–10-4mg/mL一系列不同溶度的胰蛋白酶标准溶液，通过记录加入胰蛋白酶溶液前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替胰蛋白酶标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的NiCo2O4纳米片状材料由下述方法制备的：1mmol的Ni(NO3)2·6H2O,2mmol的Co(NO3)2·6H2O和4.5mmol的六亚甲基四胺溶解于含20mL乙醇的40mL去离子水中，然后转移入100mL的聚四乙烯反应釜中，溶液在90℃下用磁力搅拌器搅拌24h，然后冷却至室温，离心得到沉淀并用去离子水和乙醇洗涤数次，产物在60℃条件下干燥12小时并在350℃下煅烧2h，以除去残余的有机物，制得NiCo2O4纳米片状材料。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的peptide@g-C3N4溶液由下述方法制备的：（1）石墨相氮化碳(g-C3N4)的制备：双氰胺在55...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈荣凯，林建华，戴宏，刘楠囡，高利红，衣欢，
申请(专利权)人：福建医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：福建,35
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