一种同时检测卡那霉素和链霉素残留的适配体传感器的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种同时检测卡那霉素和链霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：运用Cd2+和Pb2+标记卡那霉素适配体（KAP）和链霉素适配体（STP），利用Cd2+和Pb2+等金属离子可以在不同电位下产生明显的差分脉冲伏安法（DPV）峰，构建适配体传感器用于检测卡那霉素（KAN）和链霉素（STR）；引入碳纤维‑纳米金（CNFs‑AuNPs）和石墨化的碳纳米管（MWCNTGr）纳米材料，增强适配体传感器的导电性能；通过共价结合，将适配体的互补链吸附到电极表面；提出的适配体传感器对KAN和STR具有高度的敏感性，重复性和特异性；同时应用于实际牛奶样品中KAN和STR的检测；此外，通过取代适当的适配体，可用于检测其他抗生素，为快速，灵敏地检测多种抗生素提供了平台。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测卡那霉素和链霉素残留的适配体传感器的制备方法
本专利技术提供一种同时检测卡那霉素和链霉素残留的适配体传感器的制备方法，属于生物传感器

技术介绍
氨基糖苷类抗生素（AAs）是杀死或减缓细菌生长来治疗细菌感染的一种抗生素类药物，作为常用的AAs，卡那霉素（KAN）和链霉素（STR）通过卡那霉素链霉菌的发酵产生；KAN和STR在食品中的残留量可能导致严重的毒副作用，如听力下降，肝肾损害和对药物过敏等，因此，避免滥用药物和控制、监测食品中的KAN和STR残留是非常重要的。为了保护食品安全和公共健康，欧盟（EU）已经建立了牛奶中的KAN（150μg/kg）和STR（200μg/kg）的最大残留限量；因此，灵敏地检测KAN和STR的残留是有必要的，酶联免疫吸附测定（ELISA），免疫测定，气相色谱-质谱，比色和薄层色谱等多种分析方法已被用于检测动物源性食品和生物样品中的KAN和STR，虽然这些传统方法稳定可靠，但由于试剂用量大，样品预处理繁琐，步骤复杂，成本高昂等缺点，使其应用受到限制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于开发一种简单灵敏的同时检测卡那霉素和链霉素残留的适配体传感器制备方法。其技术方案为：适配体是指利用体外选择技术制备的短链单链DNA（ssDNA）或RNA序列，可选择性和灵敏地结合其预选目标物，作为生物测定中的识别探针，具有许多优点，例如低批次变异性，可用性，长期稳定性，抗变性，降解性，自动合成的适应性以及固有的选择性；因此，适配体作为生物传感应用中的分子识别元件是有希望的，迄今为止，已经产生了多种针对KAN和STR的高特异性和亲和性的适配体，在这些适配体的基础上还开发了一系列的比色和电化学适配体传感器。所述的一种同时检测卡那霉素和链霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：在同时检测多个靶标物质时，制作灵敏和可区分性的信号标签是非常重要的，Cd，Pb等金属纳米离子很容易通过差分脉冲伏安（DPV）在不同的电化学氧化还原电位下检测，在此研究中，KAN和STR的适配体分别用CdS和PbS标记。所述的一种同时检测卡那霉素和链霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：适配体与它们的互补链杂交，靶标物质可以与适配体结合，使得互补链从适配体中释放，造成相应信号的变化以定量检测靶标物质。其制备原理为：运用Cd2+和Pb2+标记KAN适配体（KAP）和STR适配体（STP），利用Cd2+和Pb2+等金属离子可以在不同电位下产生明显的DPV峰，构建适配体传感器用于同时检测KAN和STR；引入碳纤维-纳米金（CNFs-AuNPs）和石墨化的碳纳米管（MWCNTGr）纳米材料，增强适配体传感器的导电性能；通过共价结合，将适配体的互补链吸附到电极表面；提出的适配体传感器对KAN和STR具有高度的敏感性，重复性和特异性；同时应用于实际牛奶样品中KAN和STR的检测；此外，通过取代适当的适配体，可用于检测其他抗生素，为快速，灵敏地检测多种抗生素提供了平台。为达到以上目的，采取以下技术方案实现：所述的一种同时检测卡那霉素和链霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：（1）用新制备的王水（HCl:HNO3，3:1）和超纯水彻底清洗玻璃器皿，然后干燥，AuNPs前体由10mL1％HAuCl4水溶液和3.95mL1％柠檬酸三钠制备，溶液的颜色从黄色变为酒红色，这表明AuNPs的形成，将10mgOMC超声溶解于0.3mL5％nafion/乙醇溶液中以获得黑色均匀悬浮液，然后将OMC均匀悬浮液和AuNPs在磁力搅拌下混合得到OMC-AuNPs溶液，保存在4℃下棕色瓶中；（2）制备CdS/KAP和PbS/STP纳米链作为可区分的信号探针，在KAP溶液中加入Cd(NO3)2(0.2mmol/L，100mL)得到混合液A，4℃保存24小时，在混合液A中加入100mL0.2mmol/LNa2S（水/乙醇，1：1），获得混合液B并在4℃下保存24小时，然后，将Cd(NO3)2(20mmol/L，10mL)水溶液加入到混合液B中，获得混合液C并在4℃下孵育24小时，然后将Na2S(20mmol/L，10mL)加入到混合溶液C中，在4℃下孵育24小时，得到CdS/KAP纳米链，此外，基于上述相同的过程合成PbS/STP纳米链，只是Cd(NO3)2被Pb(NO3)2代替。所述适配体传感器的制备工艺如下：如图1所示，在修饰之前，在0.5MH2SO4溶液中以100mV/s的速率从-1.5V到+1.5V进行25个循环测试，丝网印刷电极（SPCE）使用循环伏安法清洁；首先，将10μLCNF悬浮液滴加在电极表面上，并通过静电作用在带负电的电极表面处形成膜；待电极干燥后将10μLOMC-AuNP悬浮液加入电极表面，由于官能团之间的共价键合和AuNPs的强吸附性，OMC-AuNPs可以强烈地粘附在CNFs/SPCE表面；接下来，将修饰电极与cKAP和cSTP的混合溶液孵育1.5小时，通过OMC-AuNP上的羧基和寡核苷酸上的氨基所形成的共价酰胺结合将寡核苷酸固定在电极表面上；制备的电极与CdS-KAP和PbS-STP的混合溶液孵育1.5小时，与cKAP和cSTP杂交，获得检测KAN和STR的传感器界面；通过用PBS洗涤除去电极上的未结合的适配体；之后，将适配体传感器在1％BSA溶液中孵育约1小时以阻断可能存在的活性位点；为了检测KAN和STR，将10μL不同浓度的KAN和STR的混合物溶液滴加到检测界面上；制备好的电极在不使用时保存在4℃下。附图说明图1为适配体传感器的组装过程。图2为透射电镜图：(a-b)CNFs-AuNPs;(c-d)MWCNTGr。图3（a）CNFs-AuNPs的TEM图像；（b）CNF-AuNPs的SEM图像；（c）C分布的EDS图；（d）Au分布的EDS图。图4（a）MWCNTGr的FT-IR透射光谱；（b）CNFs-AuNPs的FT-IR透射光谱。图5（A）组装过程的CV图；（B）纳米材料的对比CV图。图6（A）适配体传感器同时检测的交叉反应。（B）适配体传感器的纳米材料放大效果。图7（A）同时测定不同浓度的KAN和STR的DPV反应；（B）KAN的标准曲线；（C）STR的标准曲线。图8为传感器的选择性评估，K：卡那霉素，S：链霉素，G：庆大霉素，O：土霉素，T：妥布霉素。图9为加标牛奶样品中KAN的测定和回收结果图。图10为加标牛奶样品中STR的测定和回收结果图。具体实施方式实施例：图2显示了不同纳米材料的电镜表征，在高度纠缠的CNFs上，明显观察到许多亮点，表明成功制备了CNFs-AuNPs（图2（a）；图3显示了CNFs-AuNPs的TEM和SEM图像，以及元素C和Au的EDX分析结果，如图3（c）所示，C几乎完全被表面覆盖，并集中在CNFs的位置，这是因为C也是TEM铜网的主要组成部分，Au被集中在CNFs的位置，表明Au分布在CNFs的表面上；在图2（b）中，可以看出金纳米颗粒附着在CNFs的表面上；如图2（c）所示，MWCNTGr高度纠缠，表现出更光滑的形态和高度有序的石墨结构；如图2（d）所示，测得的MWCNTGr的外径为40~70nm，内径约为10nm。实施例：通过FT-IR吸收光谱进一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测卡那霉素和链霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：运用Cd2+和Pb2+标记卡那霉素适配体（KAP）和链霉素适配体（STP），利用Cd2+和Pb2+等金属离子可以在不同电位下产生明显的差分脉冲伏安法（DPV）峰，构建适配体传感器用于同时检测卡那霉素（KAN）和链霉素（STR）。

【技术特征摘要】
1.一种同时检测卡那霉素和链霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：运用Cd2+和Pb2+标记卡那霉素适配体（KAP）和链霉素适配体（STP），利用Cd2+和Pb2+等金属离子可以在不同电位下产生明显的差分脉冲伏安法（DPV）峰，构建适配体传感器用于同时检测卡那霉素（KAN）和链霉素（STR）。2.如权利要求1所述的一种同时检测卡那霉素和链霉素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于：引入碳纤维-纳米金（CNFs-AuNPs）和石墨化的碳...

【专利技术属性】
技术研发人员：王相友，李发兰，孙霞，郭业民，赵文苹，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：山东,37