一种EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的方法及装置，以紫花苜蓿品种(系)为材料，先经含盐EMS‑磷酸缓冲液处理一定时间，再利用NaCl溶液进行萌发期一次耐盐筛选和苗期一次耐盐筛选。大田种植后，收集优良变异单株的种子，在NaCl溶液下进行萌发期和苗期的二次筛选，获得耐盐紫花苜蓿。本发明专利技术的方法和装置具有操作简便、高效稳定、成本低廉等特点。生产中利用该方法，结合简单农艺性状的鉴定，可以定向创制并筛选出耐盐紫花苜蓿变异个体和群体，为紫花苜蓿的遗传、育种提供丰富的种质材料。

Method and device for directional mutagenesis and screening of salt tolerant alfalfa by EMS

The invention discloses an EMS directional mutagenesis method and a device for screening salt-tolerant alfalfa. The alfalfa variety (strain) is used as material, and is first treated with salt-containing EMS_phosphoric acid buffer solution for a certain period of time, and then the NaCl solution is used for one-time salt-tolerant screening at germination stage and one-time salt-tolerant screening at seedling stage. Salt-tolerant alfalfa was obtained by collecting the seeds of good mutant plants and screening them at Germination and seedling stages in NaCl solution. The method and device of the invention are characterized by simple operation, high efficiency, stability and low cost. By using this method and combining with the identification of simple agronomic traits, salt-tolerant individuals and populations of alfalfa can be directionally created and screened, which can provide abundant germplasm materials for alfalfa genetics and breeding.

【技术实现步骤摘要】
一种EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的方法及装置
本专利技术涉及植物育种
，具体涉及一种EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的方法及装置。
技术介绍
土壤盐渍化问题在世界范围内广泛存在，是农业生产面临的最严重的非生物逆境之一，严重影响作物生长发育；同时盐碱地具有光热资源充沛等自然禀赋，亟待开发和利用。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)为豆科多年生草本植物，具有适应性强、产草量高、适口性好等优点，是世界上栽培面积最大的牧草，被誉为“牧草之王”，具有一定的耐盐性；但盐害仍是限制和决定苜蓿广泛种植的重要因素之一，在盐碱地区进一步提高苜蓿耐盐性十分必要。培育耐盐性更强的苜蓿品种，是苜蓿在盐碱地利用的物质基础。对于耐盐性强的紫花苜蓿新品种的选育，目前主要采用传统的杂交育种或基因工程育种。但传统的杂交育种选育周期性长、耗时费力。基因工程育种仍是基于人工模拟的环境，缺少相应的品种区域特性试验研究；另外，由于植物的耐盐性是一个受多基因控制的数量性状，而目前的研究报道大多只涉及单基因的转化，这可能是限制基因工程耐盐育种发展的原因之一；再者，目前的研究报道多是在转基因品系(种)的生长早期进行的耐盐性评析，而其耐盐性是否可以维持并稳定遗传尚有待证实，且某个发育阶段的耐盐性尚不能代表植物的耐盐性。化学诱变育种具有使用方便、突变率高、后代较易稳定遗传等特点，是目前农作物育种较常用的有效手段之一。在众多化学诱变剂中，甲基磺酸乙酯(EMS)是常用的高效化学诱变剂，具有突变类型广、突变频率高、突变效率高等特点。但是EMS诱变具有多方向性，其诱变性状无法定向与预测。因此，目前尚未有关于EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的报道。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的方法。本专利技术的另一目的是提供用于EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的装置。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的方法，包括以下步骤：(1)用含盐EMS-磷酸缓冲液处理紫花苜蓿种子；(2)将步骤(1)处理后的紫花苜蓿种子置于发芽盒内，用NaCl溶液进行胁迫处理，在光照培养箱中培养至种子萌发；(3)将步骤(2)萌发的紫花苜蓿种子播种于苗期筛选装置中，并逐步提高盐胁迫浓度，筛选苗期耐盐单株；(4)将步骤(3)筛选的苗期耐盐单株移栽入大田，生长期间加强肥水管理，并进行性状观察；(5)挑选出优良变异单株，收取紫花苜蓿种子；(6)将步骤(5)的紫花苜蓿种子置于发芽盒内，用NaCl溶液进行胁迫处理，在光照培养箱中培养至种子萌发；(7)将步骤(6)萌发的紫花苜蓿种子播种于苗期筛选装置中，并逐步提高盐胁迫浓度，筛选苗期耐盐单株；(8)将步骤(7)筛选的苗期耐盐单株在大田间分单株进行播种，即获得紫花苜蓿EMS定向耐盐诱变种质。优选的，步骤(1)中，所述含盐EMS-磷酸缓冲液中，EMS的质量百分含量为1.0％，NaCl浓度为50mmol/L。优选的，步骤(1)中，紫花苜蓿种子的处理方法为：先将紫花苜蓿种子用10％的H2O2消毒处理，消毒处理后用蒸馏水冲洗，再在室温下浸种至吸胀状态，除去种子表层水分，然后用含盐EMS-磷酸缓冲液在4℃下处理3-5h，室温下处理3-5h；处理结束后，倒掉含盐EMS-磷酸缓冲液，将处理后的紫花苜蓿种子用流水冲洗1h以上。优选的，步骤(2)和步骤(6)中，采用100mmol/L的NaCl溶液进行胁迫处理。优选的，步骤(2)和步骤(6)中，在光照培养箱中保持白昼25℃，夜间20℃，进行变温培养至种子萌发。优选的，步骤(3)和步骤(7)中，所述苗期筛选装置包括：培育装置和支撑装置；所述支撑装置包括水培盒和矩形塑料支架，所述矩形塑料支架通过铁钩和连接绳可拆卸的固定于所述水培盒上；所述培育装置为72孔穴盘，所述72孔穴盘通过矩形塑料支架固定于水培盒之上，穴盘底部与水培盒内所盛液体的液面距离可通过连接绳进行调节。优选的，步骤(3)和步骤(7)中，筛选苗期耐盐单株采用的方法为：将萌发的紫花苜蓿种子播种于苗期筛选装置的穴盘中，每个穴移一株，播种深度为0.5-1厘米，逐株编号，育苗期间保证水分充足；通过控制苗期筛选装置的水培盒内NaCl的浓度和液面高度进行苗期耐盐筛选；先用清水培养7天，然后更换为营养液培养至30天，之后逐步在营养液中加入NaCl至50、100、150和200mmol/L，在盐溶液中共培养30天左右，至穴盘内苜蓿成活率在45-55％。通过调节液面的高度来模拟田间水盐运动规律，其中，用液面淹没过基质1h，模拟浇灌过程；用液面淹没过反滤层，模拟刚浇灌后田间高水位环境，用穴盘离开液面模拟水分减少供应环境。优选的，步骤(4)中，所述性状观察包括：白化、矮化、黄化、畸形苗、畸形叶、株高、分枝数、复叶数、叶片大小、生长势和生长速度。优选的，步骤(5)中，优良变异单株标准：颜色浓绿，生长势强，叶片肥大，茎叶比小，分枝多，生长速度较快，没有白化、黄化、畸形苗、畸形叶等不良性状。本专利技术的第二方面，提供一种用于EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的装置，所述装置包括：培育装置和支撑装置；所述支撑装置包括水培盒和矩形塑料支架，所述矩形塑料支架通过铁钩和连接绳可拆卸的固定于所述水培盒上；所述培育装置为72孔穴盘，所述72孔穴盘通过矩形塑料支架固定于水培盒之上，穴盘底部与水培盒内所盛液体的液面距离可通过连接绳进行调节。优选的，所述72孔穴盘的每个穴盘底部放置海绵作为反滤层，反滤层上方为基质层。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术的EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的方法操作简便、高效稳定、成本低廉。生产中可以利用该方法，结合简单农艺性状的鉴定，可以定向创制并筛选出耐盐紫花苜蓿变异个体和群体，为紫花苜蓿的遗传、育种提供丰富的种质材料。(2)本专利技术所设计的用于EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的装置，可以模拟田间水盐运动规律，为耐盐紫花苜蓿的筛选提供仿真的田间水盐运动模拟环境，提高了耐盐紫花苜蓿定向诱变筛选的成功率。附图说明图1：本专利技术的苗期筛选装置结构示意图；其中，1-水培盒，2-铁钩，3-矩形塑料支架，4-72孔穴盘，5-连接绳。图2：穴盘结构示意图；其中，6-基质层，7-反滤层。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。正如
技术介绍
中所介绍的，由于EMS诱变具有多方向性，其诱变性状无法定向与预测。为了解决这一技术难题，本专利技术经创造性的劳动，首次提出了一种EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的方法。在本专利技术的一种实施方案中，所给出的EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的方法包括以下步骤：(1)种子准备与含盐EMS-磷酸缓冲液制备：选取籽粒饱满紫花苜蓿种子，并按设定量称取该种子，配制磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)，并将甲基磺酸乙酯(EMS)和NaCl溶于该磷酸缓冲液中，制得含盐EMS-磷酸缓冲液；所述含盐EMS-磷酸缓冲液中，EMS的质量百分含量为1.0％，NaCl浓度为50mmol/L；(2)种子处理：用含盐的EMS-磷酸缓冲液处理定向诱变紫花苜蓿种子，获本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用含盐EMS‑磷酸缓冲液处理紫花苜蓿种子；(2)将步骤(1)处理后的紫花苜蓿种子置于发芽盒内，用NaCl溶液进行胁迫处理，在光照培养箱中培养至种子萌发；(3)将步骤(2)萌发的紫花苜蓿种子播种于苗期筛选装置中，并逐步提高盐胁迫浓度，筛选苗期耐盐单株；(4)将步骤(3)筛选的苗期耐盐单株移栽入大田，生长期间加强肥水管理，并进行性状观察；(5)挑选出优良变异单株，收取紫花苜蓿种子；(6)将步骤(5)的紫花苜蓿种子置于发芽盒内，用NaCl溶液进行胁迫处理，在光照培养箱中培养至种子萌发；(7)将步骤(6)萌发的紫花苜蓿种子播种于苗期筛选装置中，并逐步提高盐胁迫浓度，筛选苗期耐盐单株；(8)将步骤(7)筛选的苗期耐盐单株在大田间分单株进行播种，即获得紫花苜蓿EMS定向耐盐诱变种质。

【技术特征摘要】
1.一种EMS定向诱变、筛选耐盐紫花苜蓿的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用含盐EMS-磷酸缓冲液处理紫花苜蓿种子；(2)将步骤(1)处理后的紫花苜蓿种子置于发芽盒内，用NaCl溶液进行胁迫处理，在光照培养箱中培养至种子萌发；(3)将步骤(2)萌发的紫花苜蓿种子播种于苗期筛选装置中，并逐步提高盐胁迫浓度，筛选苗期耐盐单株；(4)将步骤(3)筛选的苗期耐盐单株移栽入大田，生长期间加强肥水管理，并进行性状观察；(5)挑选出优良变异单株，收取紫花苜蓿种子；(6)将步骤(5)的紫花苜蓿种子置于发芽盒内，用NaCl溶液进行胁迫处理，在光照培养箱中培养至种子萌发；(7)将步骤(6)萌发的紫花苜蓿种子播种于苗期筛选装置中，并逐步提高盐胁迫浓度，筛选苗期耐盐单株；(8)将步骤(7)筛选的苗期耐盐单株在大田间分单株进行播种，即获得紫花苜蓿EMS定向耐盐诱变种质。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述含盐EMS-磷酸缓冲液中，EMS的质量百分含量为1.0％，NaCl浓度为50mmol/L。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，紫花苜蓿种子的处理方法为：先将紫花苜蓿种子用10％的H2O2消毒处理，消毒处理后用蒸馏水冲洗，再在室温下浸种至吸胀状态，除去种子表层水分，然后用含盐EMS-磷酸缓冲液在4℃下处理3-5h，室温下处理3-5h；处理结束后，倒掉含盐EMS-磷酸缓冲液，将处理后的紫花苜蓿种子用流水冲洗1h以上。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(6)中，采用100mmol/L的NaCl溶液进行胁迫处理。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(6)中，在光照培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵岩，王秀华，张寒，潘香逾，孔凡美，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37