蚕蛹蛋白多肽的分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了蚕蛹蛋白多肽的分离纯化方法，该分离纯化方法的具体步骤为：将蚕蛹蛋白酶解产物溶于双蒸水中，离心后上清液即为蚕蛹蛋白多肽粗液；将蚕蛹蛋白肽液溶于双蒸水，离心后上清液加入到离子交换树脂层析柱，洗脱，收集对ACE抑制活性最好的蛋白多肽，即为离子交换层析酶解物；将离子交换层析酶解物溶于双蒸水，离心后上清液经过葡聚糖凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分；将上述凝胶层析酶解物溶于双蒸水，利用高效液相色谱进行纯化，即得蚕蛹蛋白多肽。有益效果为：本发明专利技术分离方法简单，可快速高效地分离出蛋白多肽，蛋白多肽得率高、损失低、纯度高、活性不被破坏，得到的蛋白多肽对ACE抑制活性好。

Separation and purification of silkworm chrysalis protein polypeptides

The invention discloses a method for separating and purifying silkworm pupa protein peptides. The specific steps of the method are: dissolving the hydrolysate of silkworm pupa protein in double-steaming water, and the supernatant after centrifugation is the crude liquid of silkworm pupa protein peptides; dissolving the pupa protein peptides in double-steaming water; adding the supernatant after centrifugation to the ion exchange resin column; The protein peptides with the best ACE inhibitory activity were collected and eluted by ion exchange chromatography. The protein peptides were dissolved in double-steamed water and the supernatant was separated by dextran gel column chromatography after centrifugation. The hydrolysates were dissolved in double distilled water and purified by high performance liquid chromatography. The invention has the advantages of simple separation method, rapid and efficient separation of protein polypeptides, high yield, low loss, high purity and activity without being destroyed, and the obtained protein polypeptides have good ACE inhibitory activity.

【技术实现步骤摘要】
蚕蛹蛋白多肽的分离纯化方法
本专利技术涉及多肽提取
，尤其是涉及蚕蛹蛋白多肽的分离纯化方法。
技术介绍
中国是著名丝绸古国，“丝绸之路”闻名与此，自古以来蚕桑业在中国的农业中都是重要的部分，远在七千多年前我国就有养蚕抽丝的记载。目前，世界80%的产丝量都是由我国产出。蚕蛹蛋白是一种优质蛋白资源，蛋白质的含量在干蚕蛹中高达50%左右，富含丰富的氨基酸，其中8种必需氨基酸占到总量45%左右，而必需氨基酸和非必需氨基酸是合理的，平衡的，其质量比为0.73，符合世界卫生组织/联合国粮食及农业组织（WHO/FAO）提出的参考蛋白模式，所以蚕蛹蛋白具有十分高的营养价值。我国是一个养蚕大国，平均每年新鲜蚕蛹的产量可达50万吨，蚕蛹中的蛋白比很多畜禽类的必需氨基酸含量高，其中富含具有可以促进生长发育、提高免疫力以及补充生物机体营养等功能的很多营养物质，具有巨大的市场潜力。但是由于我国长期以来对蚕蛹方面的加工利用率低下，除了干蚕蛹粉碎后应用于畜禽饲料和营养源添加外，甚至有些蚕蛹被当做肥料或者直接废弃掉，因此，造成了巨大的资源浪费。随着社会的技术和桑蚕生产的增加，蚕蛹和深入的研究和开发的综合利用已成为必须解决的问题。随着科技的发展，人们对蚕蛹蛋白的研究将更加多样化，将不断的开发出蚕蛹蛋白在食品（例如酸性饮料、肽类保健品、蚕蛹生抽等）、医药、化工、农业等行业更多应用，渗透到各个领域中，为综合利用蚕蛹、发展桑业，为国家GDP的增长贡献出一份力量。其中以蚕蛹蛋白粉为原料，采用酶解方法制备的蚕蛹蛋白肽为蚕蛹蛋白的进一步利用提供了一个方向。现有技术如授权公告号为CN103520078B的中国专利技术专利，公开了蚕蛹多肽及其制备方法、应用，多肽2的制备方法，其步骤包括（1）煎煮，（2）酶解，（3）蛋白质分离，（4）半制备RP-HPLC分离纯化，（5）冻干。上述酶解采用中性蛋白酶、复合蛋白酶酶解。上述蛋白质分离采用大孔树脂、葡聚糖凝胶。上述蚕蛹多肽2是从蚕蛹中提取多肽，安全性好，而且能有效的预防或治疗糖尿病。但是该蚕蛹多肽2的分离提纯效果不好。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种分离方法简单，可快速高效地分离出蛋白多肽，蛋白多肽得率高、损失低、纯度高、活性不被破坏，得到的蛋白多肽对ACE抑制活性好的蚕蛹蛋白多肽的分离纯化方法。本专利技术针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：蚕蛹蛋白多肽的分离纯化方法，包括蚕蛹蛋白多肽粗液制备、离子交换树脂层析、凝胶柱层析、高效液相色谱纯化，其具体步骤为：蚕蛹蛋白多肽粗液制备：按料液比为1:10-20（g/mL）将蚕蛹蛋白酶解产物溶于双蒸水总，然后在温度为1-5℃、转速为8000-10000rpm的离心机中离心8-10min，上清液即为蚕蛹蛋白多肽粗液，备用，该蚕蛹蛋白多肽粗液中成分较为复杂，因为其分子量和氨基酸序列不同而具有不同的物理特性和生物活性，为了更深入的研究，必须将其分离纯化；离子交换树脂层析：将蚕蛹蛋白肽液用双蒸水配成浓度为45-55mg/mL的溶液，然后在温度为1-5℃、转速为8000-10000rpm的离心机中离心8-10min，去除不溶性杂质，上清液加入到DEAE-52阴离子交换树脂层析柱，依次用双蒸水、0.1、0.5和1M的NaCl溶液洗脱，收集对ACE抑制活性最好的蛋白多肽，即为离子交换层析酶解物，该方法根据目标物质所带净电荷的不同，将目标物质分离出来，具有重复性好、操作简单、洗脱范围广的优势，可根据实际情况进行放大条件实现工业化生产；凝胶柱层析：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为20-30mg/mL的溶液，然后在温度为1-5℃、转速为8000-10000rpm的离心机中离心8-10min，去除不溶性杂质，上清液经过葡聚糖凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，设置检测器灵敏度为0.2A，检测器调至280nm处检测，进样量1.8-2.2mL，流速为0.5-0.8mL/min，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，备用，该方法根据酶解液在层析柱中的移动速度不同，大分子的组分先被洗脱下来，小分子的组分后被洗脱下来，从而达到分离纯化的目的，操作简便，且不需要蛋白多肽与其他物质结合，减少了纯化过程中蛋白多肽的损失，不影响目标组分化学性质，能保持蛋白多肽原有的活性不受破坏；高效液相色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80-100μg/mL的溶液，利用高效液相色谱进行纯化，即得蚕蛹蛋白多肽，色谱条件为：设置进样量为4-6μL、色谱柱为AgilentC18（250mm×4.6mm，5μm）、柱温为25-35℃、流动相为10-15%乙腈溶液、洗脱速度为0.8-1.2mL/min，该方法具有分析速度快、分辨率高、灵敏度高、分离效果好的优势，能快速分离纯化目标物质，同时该纯化步骤所需样品量少，进样量以µL为数量级，可同时分离多种成分，能反复进样，且分离过程中样品不被破坏，易回收，获得的组分纯度较高。优选的，高效液相色谱纯化步骤中乙腈溶液中含有0.05-0.07%三氟乙酸和0.003-0.005%的薄荷醇，三氟乙酸和薄荷醇可通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题，且可使得蛋白多肽和马尿酸能够达到较好的分离效果，且可延长马尿酸峰的保留时间，提高出峰速率间，使得该乙腈溶液作为流动相，可快速高效地分离出蛋白多肽，所获得的蛋白多肽的峰型较好，且出峰时间较快。优选的，高效液相色谱分离填料为改性介孔硅胶，改性介孔硅胶中2-巯基-1-甲基咪唑和2-巯基-5-甲基-1,3,4-噻二唑的偶联密度为90-110µmol/g和30-50µmol/g，该改性介孔硅胶具有更好的分离选择性和低的传质阻力，使得蛋白质酶解产物的分离更加快速高效，具有分辨率高、快速、重复性好等优点，提高了再现性、分辨率及分离目标物质的能力，另一方面该改性介孔硅胶能够提供足够大的电荷排斥作用力和合适的疏水性，具有良好的分离效果，有助于非目标物质的洗脱。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1）本专利技术分离纯化方法分离方法简单，可快速高效地分离出蛋白多肽，蛋白多肽得率高、损失低、纯度高、活性不被破坏；2）该纯化方法中高效液相色谱的流动相可改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题，可快速高效地分离出蛋白多肽，所获得的蛋白多肽的峰型较好，且出峰时间较快；3）该纯化方法中高效液相色谱用填料具有更好的分离选择性和低的传质阻力，使得蛋白质酶解产物的分离更加快速高效，具有分辨率高、快速、重复性好等优点，提高了再现性、分辨率及分离目标物质的能力，同时具有良好的分离效果，有助于非目标物质的洗脱。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术方案作进一步说明：实施例1：蚕蛹蛋白多肽的分离纯化方法，包括蚕蛹蛋白多肽粗液制备、离子交换树脂层析、凝胶柱层析、高效液相色谱纯化，其具体步骤为：1）蚕蛹蛋白多肽粗液制备：按料液比为1:10（g/mL）将蚕蛹蛋白酶解产物溶于双蒸水总，然后在温度为5℃、转速为8000rpm的离心机中离心10min，上清液即为蚕蛹蛋白多肽粗液，备用，该蚕蛹蛋白多肽粗液中成分较为复杂，因为其分子量和氨基酸序列不同而具有不同的物理特性和生物活性，为了更深入的研究，必须将其分离纯化；2）离子交换树脂层析：将蚕蛹蛋白肽液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蚕蛹蛋白多肽的分离纯化方法，包括蚕蛹蛋白多肽粗液制备、离子交换树脂层析、凝胶柱层析、高效液相色谱纯化，其特征在于：所述高效液相色谱纯化步骤为：将凝胶层析酶解物溶解，利用高效液相色谱进行纯化，即得蚕蛹蛋白多肽，所述高效液相色谱分离填料为改性介孔硅胶。

【技术特征摘要】
1.蚕蛹蛋白多肽的分离纯化方法，包括蚕蛹蛋白多肽粗液制备、离子交换树脂层析、凝胶柱层析、高效液相色谱纯化，其特征在于：所述高效液相色谱纯化步骤为：将凝胶层析酶解物溶解，利用高效液相色谱进行纯化，即得蚕蛹蛋白多肽，所述高效液相色谱分离填料为改性介孔硅胶。2.根据权利要求1所述的蚕蛹蛋白多肽的分离纯化方法，其特征在于：所述高效液相色谱纯化步骤中改性介孔硅胶中2-巯基-1-甲基咪唑和2-巯基-5-甲基-1,3,4-噻二唑的偶联密度为90-110µmol/g和30-50µmol/g。3.根据权利要求1所述的蚕蛹蛋白多肽的分离纯化方法，其特征在于：所述高效液相色谱纯化步骤中酶解物溶液的浓度为80-100μg/mL，所述色谱条件为：设置进样量为4-6μL、色谱柱为AgilentC18（250mm×4.6mm，5μm）、柱温为25-35℃、流动相为10-15%乙腈溶液、洗脱速度为0.8-1.2mL/min。4.根据权利要求1所述的蚕蛹蛋白多肽的分离纯化方法，其特征在于：所述高效液相色谱纯化步骤中乙腈溶液中含有0.05-0.07%三氟乙酸和0.003-0.005%的薄荷醇。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈贵才，王贤玉，张小朋，吴中华，聂月美，刘柳，何奇雷，程文虹，徐天华，严发杰，余有龙，
申请(专利权)人：浙江汇能生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33