用于检测氯霉素的试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测氯霉素的试纸条及其制备方法，其中用于检测氯霉素的试纸条包括支撑板，支撑板上排布硝化纤维素膜，硝化纤维素膜的一端自硝化纤维素膜起自下而上排布结合垫和样品垫，硝化纤维素膜与结合垫相对的另一端上铺设吸水垫，硝化纤维素膜上划检测线和控制线，结合垫上添加纳米金‑氯霉素适配体复合物，检测线由结合了链霉亲和素的生物素修饰的互补探针A溶液制得；控制线由结合了链霉亲和素的探针B溶液划线制得；采用以上方法制得的试纸条具有较好的一致性、稳定性和敏感性。

【技术实现步骤摘要】
用于检测氯霉素的试纸条及其制备方法
本专利技术涉及使用试纸条技术识别氯霉素，具体涉及一种用于检测氯霉素的试纸条及其制备方法。
技术介绍
氯霉素属于一种高效广谱的抗生素，但是氯霉素具有较强的毒副作用，长期摄入会使大肠杆菌、沙门氏菌等多种菌株产生耐药性，容易造成动物机体菌群失调，抵抗力下降。我国规定在所有食品动物的可食用组织中均不得检出氯霉素，因此，需要一种快速、灵敏检测生物环境中的氯霉素的方法。通常采用抗体检测氯霉素，将抗体作为生物识别因子，利用抗原抗体的特异性识别进行氯霉素检测。但是抗体成本较高，不方便保存，而且制备抗体时需要活体中产生免疫，批次稳定性较差。目前，更多的研究转向采用核酸适配体检测氯霉素，即通过一段经过体外筛选得到的寡核苷酸序列或者短的多肽，能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合。如申请日为2015年6月10日，申请公布号为CN104865216A的中国专利公开的一种基于纳米金核酸适配体比色检测氯霉素的方法，其将金纳米颗粒、能够对氯霉素特异性识别的核酸适配体和阳离子聚合物混合形成稳定的复合物；待测溶液和复合物结合释放阳离子聚合物；金纳米颗粒在阳离子聚合物的作用下团聚形成较大颗粒，导致金纳米颗粒团簇在不同波长处表现出的筒的颜色；根据颜色的变化确定待测样品中氯霉素的浓度。但是其采用的是溶液显色的方法，即需要现场配置溶液，在溶液中进行显色反应。在实际应用中较为不便。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测氯霉素的试纸条，其具有较好的一致性、稳定性和敏感性。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种用于检测氯霉素的试纸条，包括支撑板，支撑板上排布硝化纤维素膜，硝化纤维素膜的一端自硝化纤维素膜起自下而上排布结合垫和样品垫，硝化纤维素膜与结合垫相对的另一端上铺设吸水垫，硝化纤维素膜上划检测线和控制线，结合垫包被纳米金-氯霉素适配体复合物，氯霉素适配体的核苷酸序列为3’-AGC-AGC-ACA-GAG-GTC-AGA-TGA-CTG-AGG-GCA-CGG-ACA-GGA-GGG-CAT-GGA-GAG-ATG-GCG-TTT-TTT-TTT-5’，其5’端采用巯基修饰；检测线包被探针A复合物，探针A复合物由链霉亲和素和生物素修饰的探针A溶液混合制得，探针A的核苷酸序列为5’-CGC-CAT-CTC-TCC-ATG-CCC-TCC-TGT-CCG-TGC-CCT-CAG-TCA-TCT-GAC-CTC-TGT-GCT-GCT-3’，其3’端用生物素修饰；控制线包被探针B复合物，探针B复合物由链霉亲和素和生物素修饰的探针B溶液混合制得，探针B的序列为3’-AAA-AAA-AAA-5’，其3’端采用生物素修饰。本申请采用氯霉素适配体对氯霉素进行检测，并且采用试纸条法，从适配体库中筛选合适的氯霉素适配体，该氯霉素适配体一部分与氯霉素互补配对，另一部分与探针B互补配对；其中探针A和氯霉素与氯霉素适配体竞争结合。选择的氯霉素适配体的核苷酸序列一定，采用本方法检测氯霉素一致性较好。此外，本申请采用试纸条法，待测物滴在样品垫上，待测物溶液依次经过结合垫、检测线和控制线进行显色。若待测物中含有氯霉素，待测物流经结合垫时，与结合垫上的氯霉素适配体结合；结合氯霉素适配体的待测物继续流至检测线和控制线时，探针B与氯霉素适配体结合，控制线处显色。若待测物中不含氯霉素，待测物流经结合垫，氯霉素适配体继续流至检测线和控制线处，在检测线和控制线处均显色。采用该方法操作简单，仅需将待测样品滴在样品垫上即可。进一步地，纳米金-氯霉素适配体复合物按照如下方法制得：氯霉素适配体和纳米金溶液以体积比为1:5-6的比例混合，室温孵育6.5-8h，加入氯化钠至浓度为45-50mmol/L；在室温下继续活化11-12h，在6000-7000r/min的转速下离心10-15min，得到的浓缩物为纳米金-氯霉素适配体复合物。进一步地，纳米金的粒径为15-35nm。经过多次试验验证，在该粒径范围内的纳米金与氯霉素适配体结合，可以进一步提高试纸条的检测灵敏度。进一步地，纳米金采用柠檬酸三钠还原氯金酸制得，柠檬酸三钠与氯金酸以体积比为2-2.5:1的比例混合，在300-350r/min的转速下，温度为100-110℃下搅拌11-12min，制得纳米金溶液。采用以上方法制得的纳米金颗粒活性较佳，便于和巯基化的氯霉素适配体结合。进一步地，纳米金-氯霉素适配体复合物包被在结合垫上，并在35-37℃烘干7-12min。采用以上技术方案，预先将纳米金和氯霉素适配体结合制备纳米金-氯霉素适配体复合物，纳米金-氯霉素适配体复合物按照上述条件转移至结合垫上，纳米金的活性保持较持久。进一步地，探针A复合物按照如下方法制得：18-20μL浓度为2-3mg/mL的链霉亲和素与8-10μL浓度为90-100μmol/L的生物素修饰的探针A溶液在室温下混合2-2.5h。采用以上技术方案，探针A与链霉亲和素结合，显著提高检测灵敏度。进一步地，链霉亲和素采用非巯基化链霉亲和素。该链霉亲和素与生物素的亲和性更好，能与更多的生物素结合。进一步地，氯霉素的检测范围为0.5-160µg/mL。本专利技术的另一目的在于提供一种用于检测氯霉素的试纸条的制备方法，其具有检测灵敏、可直接观测检测结果的特点。本专利技术的上述目的通过以下技术方案得以实现：一种用于检测氯霉素的试纸条的制备方法，包括如下步骤：硝化纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水垫分别固定在支撑板上，样品垫、结合垫之间重叠1.5-2.5mm，支撑板宽度为4-4.5mm；支撑板上划检测线和控制线；结合垫上浸润纳米金-氯霉素适配体复合物在35-37℃烘干7-12min备用；与氯霉素适配体部分互补的探针A溶液和链霉亲和素在室温下孵育2-2.5h制得探针A复合物，并包被在检测线处；与氯霉素适配体另一部分互补的探针B溶液和链霉亲和素在室温下孵育2-2.5h制得探针B复合物，并包被在控制线处；硝化纤维素膜放置在37℃干燥8-12h，放于4℃下干燥保存。按照如上方法制作试纸条，操作简单，并且在较大程度上提高了试纸条的检测灵敏度。进一步地，样品垫采用牛血清白蛋白做封闭处理。采用以上技术方案，对纳米金进行封闭，降低纳米金与样品垫的非特异性结合，提高试纸条的检测灵敏度。综上所述，本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术制得的试纸条对颜色变化更加敏感，通过采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备纳米金，同时在制备试纸条的过程中配合不同的干燥温度，并且采用牛血清白蛋白做封闭处理，降低纳米金的非特异性结合，使得最终试纸条的视觉灵敏度可达到0.5ppm，读数仪的检测限可达到63.4ppb；2、本专利技术制得的试纸条检测氯霉素的范围较宽，通过对氯霉素适配体的浓度、链霉亲和素的种类、封闭剂的种类和浓度以及纳米金的粒径大小进行调整，最终制得的试纸条能够检测氯霉素的范围在0.5-160µg/mL之间；3、本专利技术制得的试纸条一致性较好，选用经过筛选的核酸序列一定的氯霉素适配体，采用竞争结合法，最终的检测结果通过肉眼即可观察，操作简便。附图说明图1为试纸条的结构示意图；图2为试纸条的测试原理图；图3为氯霉素标准曲线；图中，1、支撑板；2、硝化纤维素膜；3、结合垫；4、样品垫；5、吸水垫本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测氯霉素的试纸条，包括支撑板（1），支撑板（1）上排布硝化纤维素膜（2），硝化纤维素膜（2）的一端自硝化纤维素膜（2）起自下而上排布结合垫（3）和样品垫（4），硝化纤维素膜（2）与结合垫（3）相对的另一端上铺设吸水垫（5），硝化纤维素膜（2）上划检测线（6）和控制线（7），其特征在于：结合垫（3）包被纳米金‑氯霉素适配体复合物，氯霉素适配体的核苷酸序列为3’‑AGC‑AGC‑ACA‑GAG‑GTC‑AGA‑TGA‑CTG‑AGG‑GCA‑CGG‑ACA‑GGA‑GGG‑CAT‑GGA‑GAG‑ATG‑GCG‑TTT‑TTT‑TTT‑5’，其5’端采用巯基修饰；检测线（6）包被探针A复合物，探针A复合物由链霉亲和素和生物素修饰的探针A溶液混合制得，探针A的核苷酸序列为5’‑CGC‑CAT‑CTC‑TCC‑ATG‑CCC‑TCC‑TGT‑CCG‑TGC‑CCT‑CAG‑TCA‑TCT‑GAC‑CTC‑TGT‑GCT‑GCT‑3’，其3’端用生物素修饰；控制线（7）包被探针B复合物，探针B复合物由链霉亲和素和生物素修饰的探针B溶液混合制得，探针B的序列为3’‑AAA‑AAA‑AAA‑5’，其3’端采用生物素修饰。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测氯霉素的试纸条，包括支撑板（1），支撑板（1）上排布硝化纤维素膜（2），硝化纤维素膜（2）的一端自硝化纤维素膜（2）起自下而上排布结合垫（3）和样品垫（4），硝化纤维素膜（2）与结合垫（3）相对的另一端上铺设吸水垫（5），硝化纤维素膜（2）上划检测线（6）和控制线（7），其特征在于：结合垫（3）包被纳米金-氯霉素适配体复合物，氯霉素适配体的核苷酸序列为3’-AGC-AGC-ACA-GAG-GTC-AGA-TGA-CTG-AGG-GCA-CGG-ACA-GGA-GGG-CAT-GGA-GAG-ATG-GCG-TTT-TTT-TTT-5’，其5’端采用巯基修饰；检测线（6）包被探针A复合物，探针A复合物由链霉亲和素和生物素修饰的探针A溶液混合制得，探针A的核苷酸序列为5’-CGC-CAT-CTC-TCC-ATG-CCC-TCC-TGT-CCG-TGC-CCT-CAG-TCA-TCT-GAC-CTC-TGT-GCT-GCT-3’，其3’端用生物素修饰；控制线（7）包被探针B复合物，探针B复合物由链霉亲和素和生物素修饰的探针B溶液混合制得，探针B的序列为3’-AAA-AAA-AAA-5’，其3’端采用生物素修饰。2.根据权利要求1所述的用于检测氯霉素的试纸条，其特征在于：纳米金-氯霉素适配体复合物按照如下方法制得：氯霉素适配体和纳米金溶液以体积比为1:5-6的比例混合，室温孵育6.5-8h，加入氯化钠至浓度为45-50mmol/L；在室温下继续活化11-12h，在6000-7000r/min的转速下离心10-15min，得到的浓缩物为纳米金-氯霉素适配体复合物。3.根据权利要求2所述的用于检测氯霉素的试纸条，其特征在于：纳米金的粒径为15-35nm。4.根据权利要求3所述的用于检测氯霉素的试纸条，其特征在于：纳米金采用柠檬酸三钠...

【专利技术属性】
技术研发人员：董益阳，赵帅，万宇平，赵正苗，鲁亚辉，张珊，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京,11