抗肿瘤活性肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种抗肿瘤活性肽物质及其制备方法和应用，所述抗肿瘤活性肽物质包括氨基酸序列如Seq ID No.1～4所示的活性肽中的一种或几种。所述的抗肿瘤活性肽物质的制备方法，包括以下步骤：1)将豌豆蛋白水溶液热变性处理获得变性豌豆蛋白水溶液；2)酶解所述变性豌豆蛋白水溶液获得豌豆蛋白酶解液；3)超滤分级分离所述获得的豌豆蛋白酶解液，分别收集不同分子量组分；4)将所述收集到的组分中具有抗肿瘤活性的组分经分子筛层析，按峰收集各层析峰组分；5)将所述步骤4)中收集的层析峰组分经RP‑HPLC进一步分离获得抗肿瘤活性肽物质。所述抗肿瘤活性肽能高效抑制癌细胞生长且对正常细胞毒性作用甚微。

Antitumor active peptides and their preparation methods and Applications

The present invention provides an antitumor active peptide material and its preparation method and application, and the antitumor active peptide substance includes one or several of the active peptides shown by the sequence of amino acid, such as Seq ID No.1 ~ 4. The preparation method of the antitumor active peptide includes the following steps: 1) 1) the pea protein water solution is heat denatured to obtain the denatured pea protein water solution; 2) the pea protease hydrolysate is obtained by enzymatic hydrolysis of the denatured pea protein water solution; 3) the obtained pea protease hydrolysate obtained by the ultrafiltration separation and separation is collected, and the different kinds of pea protease solution are collected, respectively. Molecular weight components; 4) the components with antitumor activity in the collected components were screened by molecular sieve chromatography, the peaks were collected on the peak, and 5) the anti tumor active peptides were further separated by RP HPLC. The anti-tumor peptides can inhibit the growth of cancer cells and have little toxic effect on normal cells.

【技术实现步骤摘要】
抗肿瘤活性肽及其制备方法和应用
本专利技术属于抗肿瘤活性肽
，具体涉及抗肿瘤活性肽物质及其制备方法和应用。
技术介绍
在全球范围内，癌症的发病率和死亡率一直居高不下。大多数癌症患者的病情隐匿、潜伏期长、肿瘤生长迅速导致早期诊断困难；并且目前对于癌症的治疗主要是以手术切除为主、辅助化疗、热疗等综合治疗。经治疗后，癌症患者的病情能暂时得到控制，然而手术治疗后肿瘤的耐药、复发和转移等情况经常发生，往往成为患癌人群死亡的主要原因。因此，开发出一种安全无毒的适合癌症病人日常食用及手术等治疗后用于保健的功能性食品或针对于肿瘤病人的高效无毒的临床药物能在一定程度上缓解癌症病情和减轻患者痛苦。现代营养学研究发现，人体对蛋白质的消化吸收主要是以低肽的形式吸收。据报导，肽的吸收机制优于蛋白质和氨基酸。当前关于肽的活性研究主要集中于其抗氧化、抑菌和降血压等发面。抗肿瘤活性肽作为一种新型的治疗癌症的药物，对肿瘤细胞具有选择性、不易引起耐药性，正越来越受到人们的关注。当前关于抗肿瘤多肽的研究，主要来源是海洋生物类，制备成本高，种类少。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种高效、低成本的抗肿瘤活性肽及其制备方法和应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种抗肿瘤活性肽，包括氨基酸序列如SeqIDNo.1～4所示的活性肽中的一种或几种，所述抗肿瘤活性肽来源于豌豆蛋白酶解产物。本专利技术还提供了所述的抗肿瘤活性肽的制备方法，包括以下步骤：1)将豌豆蛋白水溶液在70℃～90℃热变性处理10min～30min，获得变性豌豆蛋白水溶液；2)酶解所述步骤1)中获得的变性豌豆蛋白水溶液，获得豌豆蛋白酶解液；3)超滤分级分离所述步骤2)获得的豌豆蛋白酶解液，分别收集分子量大于等于60KDa，[6～60)KDa，[1～6)KDa，小于1KDa的组分；4)检测上述收集到的组分的抗肿瘤活性，筛选具有抗肿瘤活性的组分；5)将步骤4)中获得的具有抗肿瘤活性的组分经分子筛层析，按峰收集各层析峰组分；6)检测步骤5)中收集的层析峰组分的抗肿瘤活性，筛选抗肿瘤活性最强的组分经反相高效液相RP-HPLC分离，收集所有出峰产物获得抗肿瘤活性肽。优选的，步骤1)中所述豌豆蛋白水溶液的质量浓度为2～8％。优选的，步骤2)中所述酶解使用的酶为碱性蛋白酶。优选的，所述碱性蛋白酶相对于变性豌豆蛋白的用量为14000～18000U/g。优选的，步骤2)中所述酶解的温度为45℃-60℃。优选的，步骤2)中所述酶解的时间为4～6h。本专利技术还提供了所述的抗肿瘤活性肽在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤功能性食品中的应用。优选的，所述肿瘤包括肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、食道癌、结肠癌或宫颈癌。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的抗肿瘤活性肽，来源于豌豆蛋白，包括氨基酸序列如SeqIDNo.1～4所示的活性肽中的一种或几种；所述抗肿瘤活性肽能高效抑制癌细胞生长且对正常细胞毒性作用甚微，对癌细胞的抑制率可达50％，而对正常细胞的抑制率在10％以下。本专利技术提供的抗肿瘤活性肽的制备方法以豌豆蛋白为原料，工艺简单，成本低廉，应用范围广泛；对开发利用含有所述抗肿瘤活性肽的临床药物奠定了理论基础；为开发利用含有所述抗肿瘤活性肽的功能性食品的生产具有指导意义。附图说明图1为本专利技术所述抗肿瘤活性肽中IPVNRPGQLQ的质谱图；图2为本专利技术所述抗肿瘤活性肽中YGPTPVRDGFK的质谱图；图3为本专利技术所述抗肿瘤活性肽中VTPGATDDQIMDGVRK的质谱图；图4为本专利技术所述抗肿瘤活性肽中GQTPLFPR的质谱图；图5为实施例2和3中四个抗肿瘤活性肽对四株人源癌细胞和一株人正常肝细胞作用的抑制率。具体实施方式本专利技术提供了一种抗肿瘤活性肽，包括氨基酸序列如SeqIDNo.1～4所示的活性肽中的一种或几种。在本专利技术中所述抗肿瘤活性肽中活性肽的氨基酸序列分别为SeqIDNo.1：IPVNRPGQLQ、SeqIDNo.2：YGPTPVRDGFK、SeqIDNo.3：VTPGATDDQIMDGVRK和SeqIDNo.4：GQTPLFPR。在本专利技术中所述抗肿瘤活性肽优选来源于豌豆蛋白，所述抗肿瘤活性肽优选的为豌豆蛋白酶解产物；所述酶解优选的为碱性蛋白酶酶解。在本专利技术中所述抗肿瘤活性肽中具体的氨基酸序列如SeqIDNo.1～4所示的活性肽的纯度优选的大于95％。本专利技术中所述活性肽可以通过豌豆蛋白酶解后分离纯化获得，也可以采用化学合成的方法获得；所述化学合成优选的委托生物公司进行，在本专利技术具体实施过程中优选的委托苏州强耀生物科技有限公司。本专利技术还提供了所述的抗肿瘤活性肽的制备方法，为酶解豌豆蛋白的方法，包括以下步骤：包括以下步骤：1)将豌豆蛋白水溶液在70℃～90℃热变性处理10min～30min，获得变性豌豆蛋白水溶液；2)酶解所述步骤1)中获得的变性豌豆蛋白水溶液，获得豌豆蛋白酶解液；3)超滤分级分离所述步骤2)获得的豌豆蛋白酶解液，分别收集分子量大于等于60KDa，[6～60)KDa，[1～6)KDa，小于1KDa的组分；4)检测上述收集到的组分的抗肿瘤活性，筛选具有抗肿瘤活性的组分；5)将步骤4)中获得的具有抗肿瘤活性的组分经分子筛层析，按峰收集各层析峰组分；6)检测步骤5)中收集的层析峰组分的抗肿瘤活性，筛选抗肿瘤活性最强的组分经反相高效液相RP-HPLC分离，收集所有出峰产物获得抗肿瘤活性肽。在本专利技术中，首先将豌豆蛋白水溶液在70℃～90℃热变性处理10min～30min获得变性豌豆蛋白水溶液。在本专利技术中，所述豌豆蛋白优选的为豌豆蛋白粉；所述豌豆蛋白粉优选的为市售豌豆蛋白粉产品；在本专利技术具体实施过程中，所述豌豆蛋白粉购于兰州百禾生物科技有限公司，产品名称：豌豆蛋白粉。在本专利技术中优选的将去离子水与所述豌豆蛋白粉混合配制豌豆蛋白水溶液；所述豌豆蛋白水溶液的质量浓度优选的为2～8％，更优选的为4～6％。本专利技术在获得豌豆蛋白水溶液后，对所述豌豆蛋白水溶液进行热变性处理；所述热变性处理的温度优选的为75～85℃，更优选的为78～82℃；所述热变性处理的时间优选的为15～25min，更优选的为17～23min。在本专利技术中所述热变性处理的目的为使豌豆蛋白水溶液中的豌豆蛋白变性，更利于提高后续酶解效率。本专利技术在获得变性豌豆蛋白水溶液后，酶解所述变性豌豆蛋白水溶液获得豌豆蛋白酶解液。在本专利技术中所述酶解使用的酶优选的为碱性蛋白酶；本专利技术中所述碱性蛋白酶采用市售的碱性蛋白酶即可，对厂家和货号无特殊要求。在本专利技术酶解过程中所述碱性蛋白酶相对于变性豌豆蛋白的用量优选的为14000～18000U/g，更优选的为15000～17000U/g。在本专利技术中所述酶解的温度优选的为45℃-60℃，更优选的为50～55℃；所述酶解的时间优选为4～6h，更优选的为4.5～5.5h。本专利技术中所述酶解优选的采用水浴的方式进行。本专利技术中所述酶解将所述变性豌豆蛋白分解为小分子多肽。本专利技术在所述酶解结束后，优选的将所述获得的豌豆蛋白酶解液进行沸水浴加热处理。在本专利技术中，所述沸水浴的温度优选为90℃～100℃；所述沸水浴的时间优选为10～15min。在本专利技术中，所述沸水浴加热通过高温加热灭活残留在豌豆蛋白酶解液中的碱性蛋白酶。本专利技术在获得所述豌豆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗肿瘤活性肽，其特征在于，包括氨基酸序列如Seq ID No.1～4所示的活性肽中的一种或几种；所述抗肿瘤活性肽物质来源于豌豆蛋白酶解产物。

【技术特征摘要】
1.抗肿瘤活性肽，其特征在于，包括氨基酸序列如SeqIDNo.1～4所示的活性肽中的一种或几种；所述抗肿瘤活性肽物质来源于豌豆蛋白酶解产物。2.权利要求1所述的抗肿瘤活性肽的制备方法，包括以下步骤：1)将豌豆蛋白水溶液在70℃～90℃热变性处理10min～30min，获得变性豌豆蛋白水溶液；2)酶解所述步骤1)中获得的变性豌豆蛋白水溶液，获得豌豆蛋白酶解液；3)超滤分级分离所述步骤2)获得的豌豆蛋白酶解液，分别收集分子量大于等于60KDa，[6～60)KDa，[1～6)KDa和小于1KDa的组分；4)检测上述收集到的组分的抗肿瘤活性，筛选具有抗肿瘤活性的组分；5)将步骤4)中获得的具有抗肿瘤活性的组分经分子筛层析，按峰收集各层析峰组分；6)检测步骤5)中收集的层析峰组分的抗肿瘤活性，筛选抗肿瘤活性最强的组分经反相高效液相RP-HPLC分离，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王艳萍，潘芬，王金菊，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12