一种检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒及其制备方法，属于分子生物学和医学领域。所述荧光试剂盒包括荧光标记大肠杆菌，其特征在于：还包括荧光标记铜绿假单孢菌。所述荧光试剂盒的制备方法包括如下步骤：1.大肠杆菌/铜绿假单孢菌的扩增与浓度检测；2.荧光标记大肠杆菌；3.荧光标记铜绿假单孢菌的制备。本发明专利技术的荧光试剂盒包含有可以被细胞吞噬的荧光标记大肠杆菌和荧光标记铜绿假单孢菌，能够通过检测细胞内荧光信号的强弱来判断细胞吞噬的细菌数量，从而确定细胞的吞噬活性。

A fluorescence kit for detecting phagocytosis of cells and its preparation method

The invention relates to a fluorescence kit for detecting phagocytosis of cells and a preparation method thereof, belonging to the field of molecular biology and medicine. The fluorescent kit comprises fluorescent labeled Escherichia coli, and is characterized by fluorescent labeling of Pseudomonas aeruginosa. The preparation methods of the fluorescent kit include the following steps: 1. the amplification and concentration detection of Escherichia coli / Pseudomonas aeruginosa, 2. fluorescent labeled Escherichia coli, and 3. fluorescent labelled Pseudomonas aeruginosa. The fluorescent kit of the invention includes the fluorescent labeled Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa, which can be phagocytic by cells, and can determine the number of bacteria phagocytic by detecting the intensity of intracellular fluorescence signal, thus determining the phagocytosis activity of the cells.

【技术实现步骤摘要】
一种检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及一种检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒及其制备方法，属于分子生物学和医学领域。
技术介绍
吞噬作用是生物体最古老的，也是最基本的防卫机制之一。吞噬细胞具有对异物吞噬和消化的功能，当病原微生物侵入机体后，在激发免疫应答以前即可被吞噬细胞吞噬并清除，这在机体非特异性免疫中具有重要意义。不同的基因表达、细胞因子、药物等均可以通过改变细胞的吞噬功能，对机体的非特异性免疫产生影响，因此，测量吞噬细胞的吞噬能力具有十分重要的科学研究和临床意义。现有检测细胞吞噬的传统方法有吞噬中性红法，吞噬鸡血红细胞法等，但存在敏感度有限，试剂难以保存等问题，国外有用荧光法检测细胞吞噬功能的试剂盒，虽然敏感度有所提高，但也存在一定缺陷，如应用范围窄，只能用于测定贴壁细胞的吞噬效率，对于中性粒细胞等悬浮细胞检测效果不佳；检测手段单一，只能使用荧光酶标仪进行检测，无法获得吞噬细胞的形态学图像；荧光颗粒单一，试剂盒中的荧光颗粒仅为荧光标记的大肠杆菌一种，而且该试剂盒仅能进口，价格昂贵，不利于广大基层实验室进行科学研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒及其制备方法，所述荧光试剂盒包含有可以被细胞吞噬的荧光标记大肠杆菌和荧光标记铜绿假单孢菌，能够通过检测细胞内荧光信号的强弱来判断细胞吞噬的细菌数量，从而确定细胞的吞噬活性。本专利技术的第一个目的通过以下的技术方案实现：一种检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒，包括荧光标记大肠杆菌，其特征在于：还包括荧光标记铜绿假单孢菌。通过采用上述技术方案，利用荧光标记大肠杆菌和荧光标记铜绿假单孢菌共同检测吞噬细胞的吞噬活性，避免了仅用一种荧光颗粒检测导致的实验偏差，使结果更为全面和可靠。作为所述荧光试剂盒的进一步改进，所述荧光标记大肠杆菌和/或荧光标记铜绿假单孢菌为冻干粉。通过采用上述技术方案，由于本试剂盒需要避光保存以防荧光淬灭，而荧光标记细菌经过真空冻干为冻干粉后，可以在4℃短期保存及运输，在-20℃长期保存。作为所述荧光试剂盒的进一步改进，所述荧光标记大肠杆菌和荧光标记铜绿假单孢菌具有FITC的荧光标记。通过采用上述技术方案，在碱性条件下，FITC的碳酰胺键可与细菌壁上赖氨酸的ε氨基共价结合，在480nm的激发光源下，可以产生520nm的黄绿色荧光，通过在荧光显微镜、共聚焦显微镜下观察或用荧光酶标仪、流式细胞仪分析荧光的位置和强弱，可对细菌进行定位、半定量、定量的检测，从而计算出细胞的吞噬活性。作为所述荧光试剂盒的进一步改进，所述荧光试剂盒还包括缓冲液和用于给细胞核染色的细胞核染色剂。通过采用上述技术方案，缓冲液既可以维持生物的正常pH值和正常生理环境，又可以用来溶解细菌；细胞核染色剂用于给细胞核染色，便于提高观测精度。作为所述荧光试剂盒的进一步改进，所述荧光试剂盒还包括用于淬灭多余荧光的台盼蓝溶液。通过采用上述技术方案，台盼蓝溶液可用于淬灭未被吞噬也未被洗去的细菌荧光，减少干扰，提高检测精确度。作为所述荧光试剂盒的进一步改进，所述细胞核染色剂采用EB溶液。通过采用上述技术方案，细胞核染色剂采用EB溶液，可以用于细胞核的着色定位，在荧光显微镜下，在480mm的激发光源下可产生橘黄色荧光，有利于提高观察精度。作为所述荧光试剂盒的进一步改进，所述缓冲液为Hanks平衡盐缓冲液。Hanks平衡盐缓冲液具有以下优点：(1)Hanks平衡盐缓冲液是生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液，具有普适、廉价、高效的优点。(2)Hanks平衡盐缓冲液与细胞生长状态下的pH值、渗透压等环境状态一致，具有维持渗透压、控制酸碱平衡、供给细胞生存代谢所必需的能量和无机盐成分等作用，可满足体外实验中，细胞生存并维持一定的代谢的基本需要。(3)Hanks平衡盐缓冲液可按需配置所需pH值。(4)Hanks平衡盐缓冲液保存时间长，利用效率高。本专利技术的第二个目的通过以下的技术方案实现：检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1.大肠杆菌/铜绿假单孢菌的扩增与浓度检测：取大肠杆菌，扩增至OD值为3.4～3.48，浓度为10.5×108；取铜绿假单孢菌，扩增至OD值为3.4～3.48，浓度为10.5×108；2.荧光标记大肠杆菌的制备：用10×浓缩Hanks平衡盐缓冲液将大肠杆菌浓度调至1～2×109CFU/ml，取2×108的大肠杆菌到离心管中，加入1ml的FITC溶液，混匀；加入大肠杆菌的FITC溶液在室温下孵育20分钟；以8000g速度离心10分钟，除去上清，加入1mlHBSA溶液将沉淀吹散洗涤，重复3次，最后用100ul的HBSA溶液重悬沉淀，即获得荧光标记荧光标记大肠杆菌；3.荧光标记铜绿假单孢菌的制备：用10×浓缩Hanks平衡盐缓冲液将铜绿假单孢菌浓度调至1～2×109CFU/ml，取2×108的铜绿假单孢菌到离心管中，加入1ml的FITC溶液，混匀；加入铜绿假单孢菌的FITC溶液在室温下孵育20分钟；以8000g速度离心10分钟，除去上清，加入1mlHBSA溶液将沉淀吹散洗涤，重复3次，最后用100ul的HBSA溶液重悬沉淀，即获得荧光标记铜绿假单孢菌。作为所述制备方法的进一步改进，所述FITC溶液采用如下方法配制：1.配制基本液：每100ml基本液包括碳酸氢钠4.2g、氢氧化钠2g、氯化钠5.84g，用水定容至100ml，基本液中各种成分的终浓度为0.5mg/ml，溶质是碳酸钠和氯化钠，将基本液的PH值调为9；2.配制FITC溶液：取基本液，加FITC，配成0.5mg/ml的FITC溶液，现用现配。作为所述制备方法的进一步改进，所述HBSA溶液采用如下方法配制：每100ml的10×浓缩Hanks平衡盐缓冲液中加入0.25g的BSA和0.046g的HEPES。本专利技术与现有技术相比，具有如下优点：1)、应用范围广：本专利技术可用于检测悬浮和贴壁的各种具有吞噬功能的细胞的吞噬活性；2)、检测手段多样：本专利技术既可以使用荧光显微镜、共聚焦显微镜获得细胞吞噬细菌后的形态学图片，又可以使用荧光酶标仪、流式细胞仪对细菌进行半定量及定量检测，从而计算出细胞的吞噬活性。3)、荧光颗粒多样：本专利技术包含了荧光标记大肠杆菌和荧光标记铜绿假单孢菌两种荧光颗粒，避免了仅用一种荧光颗粒检测导致的实验偏差，使结果更为全面和可靠。4)、便于运输和储存：本专利技术荧光标记大肠杆菌和荧光标记铜绿假单孢菌为冻干粉，可以4℃运输和短期保存，并不会降低荧光强度，标记效率稳定，方便使用和检测。5)、成本低廉：本专利技术为首个国产的检测细胞吞噬作用的试剂盒，价格较进口产品大幅降低。附图说明图1为荧光标记大肠杆菌图片；图2为荧光标记铜绿假单孢菌图片；图3为流式细胞仪检测大肠杆菌的散点图；图4为流式细胞仪检测未被荧光标记的大肠杆菌的直方图；图5为流式细胞仪检测FITC荧光标记大肠杆菌的直方图；图6为原代培养小鼠腹腔巨噬细胞光镜(400×)图片；图7为流式细胞仪检测巨噬细胞的散点图；图8为流式细胞仪检测巨噬细胞吞噬FITC荧光标记细菌前的直方图；图9为流式细胞仪检测巨噬细胞吞噬FITC荧光标记细菌后的直方图；图10为荧光显微镜检测检测巨噬细胞吞噬FI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒，包括荧光标记大肠杆菌，其特征在于：还包括荧光标记铜绿假单孢菌。

【技术特征摘要】
1.一种检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒，包括荧光标记大肠杆菌，其特征在于：还包括荧光标记铜绿假单孢菌。2.如权利要求1所述的检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒，其特征在于：所述荧光标记大肠杆菌和/或荧光标记铜绿假单孢菌为冻干粉。3.如权利要求1所述的检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒，其特征在于：所述荧光标记大肠杆菌和荧光标记铜绿假单孢菌具有异硫氰酸荧光素(FITC)的荧光标记。4.如权利要求1～3任一项所述的检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒，其特征在于：所述荧光试剂盒还包括缓冲液和用于给细胞核染色的细胞核染色剂。5.如权利要求4所述的检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒，其特征在于：所述荧光试剂盒还包括用于淬灭多余荧光的台盼蓝溶液。6.如权利要求4所述的检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为Hanks平衡盐缓冲液。7.如权利要求4所述的检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒，其特征在于：所述细胞核染色剂采用EB溶液。8.权利要求1～7任一项所述的检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1.大肠杆菌/铜绿假单孢菌的扩增与浓度检测：取大肠杆菌，扩增至OD值为3.4～3.48，浓度为10.5×108；取铜绿假单孢菌，扩增至OD值为3.4～3.48，浓度为10.5×108；2.荧光标记大肠杆菌的制备：用10×浓缩Hanks平衡盐缓冲液将大肠杆菌浓度调至1～2×109CFU/ml，取2×108的大肠杆菌到离心管中，加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洵，强鑫垚，刘怿君，
申请(专利权)人：王洵，
类型：发明
国别省市：江苏,32