生产高价值天然产物的工程菌的构造方法技术

本发明专利技术涉及一种生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，以及用这种构造方法所制造的生产高价值天然产物的工程菌。该方法为将人工调控组件导入宿主细胞，每个所述宿主细胞内存在一个或者多个、一种或多种人工调控组件，所述人工调控组件包括载体、启动子、5’非翻译区和编码模块，所述编码模块可操作地连接于人工调控组件，所述编码模块包括hmgS‑atoB‑hmgR模块、mevK‑pmk‑pmd‑idi模块、crtE‑crtB‑crtI‑ispA模块、crtY模块、crtY‑crtZ‑crtW模块、ispA‑nls模块或者GPPS‑nls模块。使用人工调控组件可以方便进行全局优化筛选，而选择不同的人工调控组件，能够兼顾全局和局部，不同的载体、不同的启动子序列、不同的RBS序列、不同的酶组合。

Construction method of engineering bacteria producing high value natural products

The present invention relates to a construction method for producing engineering bacteria of high value natural products, and engineering bacteria produced by this method of producing high value natural products. This method is to import an artificial control component into the host cell, each of the host cells in one or more, one or more manual control components, which include a carrier, a promoter, a 5 'non - translation zone, and a coding module. The encoding module is operable to be connected to an artificial control component. The code modules include the hmgS atoB hmgR module, the mevK PMK PMD IDI module, the crtE crtB crtI ispA module, the crtY module, the module or the module. The use of artificial control components can be convenient for global optimization screening, and the selection of different artificial control components can take into account the global and local, different carriers, different promoter sequences, different RBS sequences, and different enzyme combinations.

【技术实现步骤摘要】
生产高价值天然产物的工程菌的构造方法
本专利技术涉及一种生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，以及用这种构造方法所制造的生产高价值天然产物的工程菌。
技术介绍
目前天然产物的主要来源是生物提取（主要来源于植物）。然而由于在植物体内的天然产物含量很低并且有很多同属性杂质，其提取效率较低而且成本极其高昂。而且很多植物的生长周期很长因此只能利用野生植物，这种提取方案对许多稀有生物和生物多样性都构成严重威胁（如需要六颗生长百年的太平洋红豆杉才能提纯一剂量的紫杉醇，因此大量太平洋红豆杉被砍伐）。同时化学合成的化合物在结构（手性）、功能及安全性（残留有毒原料及中间体）等方面都与天然产物有着显著差距。随着合成生物学和代谢工程领域取得了空前的发展，用微生物来合成天然产物有着显著优势。相比植物提纯、微生物生长快速、生产周期短。并且经过工程优化的菌种，天然产物含量高纯度高，下游分离成本低。同时植物的生长需要占用大量耕地，而微生物发酵几乎不需要占用耕地。相比化学合成的化合物，微生物生产的产物不但更加环保和可持续，还有与天然产物具有完全一样的手性和生物活性等优势。工程化的微生物系统依赖于对许多相互依存的变量控制（如基因表达水平）。通过改变构成这些系统的遗传成分，我们可以调节基因表达水平和其他参数，以了解这些系统如何应对这些变化。目前，生物合成途径的工程优化主要采用组合技术，如全局转录机械工程和多重自动基因组工程来产生途径变体文库，并筛选出所需的表型。最近，依赖于组合装配的半定量方法已被用于DNA组件设计生物合成途径变体的文库。作为之前的一些案例，新型DNA组件（例如载体、启动子，核糖体结合位点（RBS））及酶变体已经被广泛开发并应用于设计和构建路径变体。具体来说，主要分成两大部分，一是全局设计方案，如启动子的案例。然而由于一个启动子同时调控几个基因的表达水平，导致这种全局方案无法调节这几个基因之间存在巨大差异（如蛋白质的表达量及其活性差异）。另一种是局部设计方案，这个方案主要调节几个关键基因，可以使用启动子或核糖体结合位点（RBS）来控制。这种局部方案存在忽视其系统中未被控制基因等潜在问题（如活性不足或过强表达），因而同样会导致生物系统的非优值。基于此，这里提出一个新的方案，多维度控制系统方法（MCO）。MCO方法兼顾全局和局部，全局由载体或启动子或两者组合来控制，局部由RBS或酶变体或两者组合来优化。因此MCO方法更加灵活高效，并可以得到更优的工程化生物系统。同时结合有效筛选（颜色或质谱）和统计模型，MCO方法比之前的方法需要更少的系统参数数据，并可以利用预测模型（如果存在统计显着的系统与变量关系）来不断优化和提高系统。本文以甲羟戊酸途径在大肠杆菌的优化为例，证明MCO方法不仅可以应用于有色化合物（虾青素和胡萝卜素、蕃茄红素）还可以应用其他无色化合物（如萜类化合物，橙花叔醇和芳樟醇）的生产优化，阐明该方案的优越性和广泛适用性。在自然界，与其他中间产物相比，虾青素具有更强的抗氧化性和生物活性。虾青素可以保护动植物组织不受紫外线损坏，还有很强的抗炎特性及抑制多种恶性肿瘤的生长。此外，虾青素还能预防动脉粥样硬化性心血管疾病和糖尿病，增强肌肉耐力，提升运动表现。因而广泛应用于食品、饲料、医药、保健品和化妆品等领域，市场需求巨大并且在快速增长。2016年调查数据显示，全球合成虾青素和天然虾青素的总市场规模在5.5亿美元，并预计在2025年将达到25.7亿美元。与虾青素相似，蕃茄红素和β胡萝卜素也是重要的天然色素，具有较强的抗氧化活性，而且对于增强人体免疫力、预防慢性疾病、促进细胞缝隙间连接交流、减少动脉硬化、延缓衰老以及有效抑制癌细胞的增殖等都具有重要意义，广泛用于药品、化妆品、保健品和食品添加。橙花叔醇是一种香料广泛用于各种化妆品（例如洗发水和香水）和非化妆品（例如洗涤剂和家用清洁剂）。而且，最近的研究表明橙花叔醇还具有许多药理和生物活性（抗氧化，抗微生物，抗生物膜，抗寄生和抗炎等）。芳樟醇是另一种重要的香料，不但被应用于在绝大多数化妆品及洗漱用品（沐浴露，洗发水和肥皂等），还具有镇静，抗焦虑和止痛作用等生物活性，因此市场前景尤为广阔。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种能既进行全局调控，又能进行局部调控的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法以及应用该方法得到的生产高价值天然产物的各种工程菌。本专利技术解决上述各种问题所采用的技术方案是：该生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：将人工调控组件导入宿主细胞，每个所述宿主细胞内存在一个或者多个、一种或多种人工调控组件，所述人工调控组件包括载体、启动子、5’非翻译区和编码模块，所述编码模块可操作地连接于人工调控组件，所述编码模块包括hmgS-atoB-hmgR模块、mevK-pmk-pmd-idi模块、crtE-crtB-crtI-ispA模块、crtY-crtZ-crtW模块、crtE-crtB-crtI-ispA模块、ispA-nls模块或者GPPS-nls模块。各个模块中基因的意义如下，atoB为乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因，hmgS为HMG-CoA合酶基因，hmgR为HMG-CoA还原酶基因，mevK为甲羟戊酸激酶基因,pmk为磷酸羟脯氨酸激酶基因,pmd为甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧酶基因，idi为异戊烯焦磷酸异构酶基因，ispA为法呢基焦磷酸合成酶基因，crtE为香叶基香叶基焦磷酸合酶基因，crtB为八氢番茄红素合酶基因，crtI为八氢番茄红素去饱和酶基因，crtY为番茄红素环化酶基因，crtZ为β-胡萝卜素羟化酶基因，crtW为β-胡萝卜素酮化酶基因，nls为橙花叔醇/芳樟醇合酶基因，GPPS为香叶基焦磷酸合酶基因。比如hmgS-atoB-hmgR模块就是包含hmgS基因、atoB基因和hmgR基因的编码模块。编码模块中的每个酶基因都相对应的在5’非翻译区设置有核糖体结合位点（RBS），比如在人工调控组件的编码模块是hmgS-atoB-hmgR模块，那么有三个核糖体结合位点（RBS）分别控制hmgS基因、atoB基因和hmgR基因。工程菌的优化步骤为，a.构建载体库、启动子库、5’非翻译区库和酶变体库；b.全局调控载体和启动子和局部微调5’非翻译区和酶变体。通过预定义的生物调节元件（载体，启动子和RBS）以及关键酶库以高维的方法形成菌体库，再辅以适当的筛选方法来得到最优菌株。不同于现有高通量方法（全局转录工程gTME（Alper,H.,Moxley,J.,Nevoigt,E.,Fink,G.R.&Stephanopoulos,G.Engineeringyeasttranscriptionmachineryforimprovedethanoltoleranceandproduction.Science314,1565-1568(2006).）），多重自动基因组工程MAGE（Wang,H.H.etal.Programmingcellsbymultiplexgenomeengineeringandacceleratedevolution.Nature460,894-898(2009).），可调节基因间区域TIGR（Pfleger,B.F.,Pitera,D.J.,本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：将人工调控组件导入宿主细胞，每个所述宿主细胞内存在一个或者多个、一种或多种人工调控组件，所述人工调控组件包括载体、启动子、5’非翻译区和编码模块，所述编码模块可操作地连接于人工调控组件，所述编码模块包括hmgS‑atoB‑hmgR模块、mevK‑pmk‑pmd‑idi模块、crtE‑crtB‑crtI‑ispA模块、crtY模块、crtY‑crtZ‑crtW模块、ispA‑nls模块或者GPPS‑nls模块。

【技术特征摘要】
1.一种生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：将人工调控组件导入宿主细胞，每个所述宿主细胞内存在一个或者多个、一种或多种人工调控组件，所述人工调控组件包括载体、启动子、5’非翻译区和编码模块，所述编码模块可操作地连接于人工调控组件，所述编码模块包括hmgS-atoB-hmgR模块、mevK-pmk-pmd-idi模块、crtE-crtB-crtI-ispA模块、crtY模块、crtY-crtZ-crtW模块、ispA-nls模块或者GPPS-nls模块。2.根据权利要求1所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：所述5’非翻译区包括核糖体结合位点（RBS）。3.根据权利要求2所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：通过载体或启动子或两者组合来控制来进行全局调控，通过所述核糖体结合位点（RBS）或酶变体或两者组合来优化进行局部调控。4.根据权利要求3所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：所述全局调控为对整个生物合成途径的所有酶的调控，对所有酶进行分组模块化以减少组合数量，每个模块都通过量化的载体或启动子或两者组合来控制。5.根据权利要求4所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：在所述全局调控的基础上，所述局部调控是对整体生物系统效率的进一步提升，模块分组可能导致单个或几个模块成为整体生物系统的瓶颈，而所述全局调控无法实现瓶颈模块的内部优化，因此，采用不同强度的5’非翻译区或不同活性的酶变体或两者组合来实现瓶颈模块的局部优化。6.根据权利要求3或4所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：所述全局调控和所述局部调控可同步也可以分步进行。7.根据权利要求1所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：所述宿主细胞为大肠杆菌。8.根据权利要求1所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：所述载体为pBR322或p15A或pMB1或ColE1或pSC101或它们的变体。9.根据权利要求1所述的生产高价值天然产物的工程菌的构造方法，其特征在于：所述启动子为T7、TM1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：张聪强，
申请(专利权)人：杭州爱蔻思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33