一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法技术

本发明专利技术提供了一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法，涉及材料学、光分析化学、纳米生物传感等技术领域。本发明专利技术是基于核酸适配体和目标物(OTA和AFB1)的特异性识别作用并借助荧光光度计来实现信号输出，该方法有特异性高、稳定性强、对周围环境要求不高等特点。本发明专利技术运用的磁性纳米微球和二氧化硅纳米球具有较大的比表面积和良好的生物相容性，能够负载更多的信号分子，可以有效提高检测的灵敏度；以同一激发波长下不同发射波长的gQDs和rQDs作为荧光信标构建了磁控荧光适配体传感器，实现了对OTA和AFB1的同时检测。

Preparation of aptamer sensor for simultaneous detection of two mycotoxins

The invention provides a method for the preparation of an aptamer sensor for the simultaneous detection of two mycotoxins, which involves the technical fields of material science, optical analytical chemistry and nano biosensor. The invention is based on the specific recognition of aptamers and targets (OTA and AFB1) and uses a fluorescence photometer to realize the signal output. The method has the characteristics of high specificity, strong stability and low requirements for the surrounding environment. The magnetic nanospheres and silica nanospheres used in the invention have large specific surface area and good biocompatibility, and can load more signal molecules and can effectively improve the sensitivity of detection. GQDs and rQDs with different emission wavelengths at the same excitation wavelength are used as fluorescent beacons to construct a magnetic fluorescent aptamer transmission. Sensilla, the simultaneous detection of OTA and AFB1 is realized.

【技术实现步骤摘要】
一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法
本专利技术涉及一种磁控荧光检测的适配体传感器的构建方法，特点在于能够实现对赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)和黄曲霉毒素B1(AflatoxinB1,AFB1)的同时检测，灵敏度高，重现性好，具有较宽的检测范围；涉及材料学、光分析化学、纳米生物传感等

技术介绍
霉菌毒素主要是指霉菌在其所污染的食品中产生的有毒代谢产物，其中黄曲霉毒素和赭曲霉毒素是谷物及其制品中最常见的霉菌毒素。黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一类次级代谢产物，在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1(AFB1)最多见，而且其致癌性也最强，毒性最大。AFB1已经被世界卫生组织(WHO)和国际癌症研究机构(IARC)列为Ⅰ类致癌物，与人类肝癌的发生有密切关系。赭曲霉毒素是由赭曲霉和纯绿青霉产生的一类结构类似的化合物，其中毒性最大、分布最广、产毒量最高、对农产品的污染最重、与人类健康关系最密切的是赭曲霉毒素A(OTA)。尽管现代农业技术和食品加工工艺较为先进，却还是难以避免在作物的生长、储存以及加工中霉菌的滋生，并且这些霉菌毒素也可能会由于畜禽食用含有霉菌毒素的食物而进入到其蛋和乳中，进而进入到人类食物链中。因此，构建灵敏的检测方法对两种及以上霉菌毒素进行同时检测，具有十分重要的意义。纳米材料作为一种最具有广泛应用前景的材料，其潜在的重要性毋庸置疑，由于其独特的表面效应，体积效应以及量子尺寸效应，使得材料的性能产生惊人的变化。纳米材料较大的比表面积可以增加信号分子负载量，有效地提高检测灵敏度；除此之外，有些纳米材料还可以提高传感界面的导电性、电催化活性、化学亲和性等，使得生物传感器具有更优异的稳定性和重现性。在纳米材料中，金纳米粒子，二氧化硅纳米粒子，铁氧化物纳米材料，碳纳米管、石墨烯等纳米材料均被用作优良的载体负载信号分子，用于高灵敏检测蛋白质、DNA和生物小分子等。量子点(QDs)是近几年发展起来的一种新型纳米材料，由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的一种准零维的纳米颗粒。量子点凭借其独特的光谱特征和光化学稳定性等特点，在电磁学、光学、催化和生物传感领域具有极大的应用前景。借助纳米材料独特的性能来构建生物传感器用于霉菌毒素的检测，可以显著增强检测方法的灵敏度。核酸适配体(aptamer)是一段单链寡核苷酸序列，对靶标具有高亲和性和特异性。作为一种新型识别元件，核酸适配体不仅具有类似抗体的特性，而且具有抗体没有的优势，比如合成简单，化学性质稳定，重现性好，易于储存和运输，方便再生。此外，核酸适配体可利用官能团，荧光团，生物素和酶等进行功能化，简化检测步骤，使得传感平台的构建更加灵活。目前，相关研究人员已设计了多种适配体传感体系，分别利用电化学、化学发光、荧光和比色等研究手段，实现了对OTA、伏马菌毒素B1、黄曲霉毒素M1和黄曲霉毒素B1等典型霉菌毒素的分析检测。然而，能够实现同时检测两种甚至多种霉菌毒素的方法却鲜有报道。鉴于霉菌毒素对农产品的污染并不是单一存在的，一旦温度湿度合适，多种霉菌毒素便会同时滋生，进而产生毒性叠加效应，严重危害人类的身体健康。因此，简化检测步骤，提高检测灵敏度，建立多种毒素同时检测的方法是霉菌毒素检测的发展方向。与单组分霉菌毒素检测相比，同时检测技术具有明显的优势，如：缩短分析时间，减少样本需求量，大幅降低检测成本，提高了食品安全监控的效率。
技术实现思路
本专利技术旨在专利技术一种工艺简单、检测时间短、低成本的可用于两种霉菌毒素同时检测的磁控荧光适配体传感器。所构建的新型传感器，可以有效解决现有检测方法检测程序复杂、成本高、耗时过长、重现性较差、灵敏度较低等难题。所采用的方案概括为：首先，制备发射绿色荧光的碲化镉量子点(记为gQDs)和发射红色荧光的碲化镉量子点(记为rQDs)，进而利用静电吸附作用分别实现gQDs和rQDs在SiO2纳米球表面的大量均匀负载，得到gQDs包覆的SiO2杂化纳米球(记为SiO2@gQDs)和rQDs包覆的SiO2杂化纳米球(记为SiO2@rQDs)，并将其作为荧光信标与OTA适配体互补链(记为cDNA1)和AFB1适配体互补链(记为cDNA2)藕联；其次，以OTA-Aptamer(记为Apt1)藕联的金包四氧化三铁壳-核磁性纳米球(记为MBs)为捕获探针(记为MBs-Apt1)，以cDNA1藕联的SiO2@gQDs纳米球为信号探针(记为cDNA1-SiO2@gQDs)，通过Apt1与cDNA1之间的杂交反应将信号探针与捕获探针藕连，得到纳米生物复合物1(记为MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs)。相同方法以AFB1-Aptamer(记为Apt2)藕联的MBs为捕获探针(记为MBs-Apt1)，以cDNA2藕联的SiO2@rQDs纳米球为信号探针(记为cDNA2-SiO2@rQDs)制备得到纳米生物复合物2(记为MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs)。上述两种纳米生物复合物与目标物OTA和AFB1作用后，Apt1与OTA以及Apt2与AFB1的特异性结合会使部分的cDNA1-SiO2@gQDs和cDNA2-SiO2@rQDs从MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs和MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs纳米生物复合物上脱附,通过外加磁场对混合物进行分离并收集脱附的信号探针，构建磁控荧光适配体传感体系，实现对OTA和AFB1的同时检测。该磁控荧光适配体传感方法可以大大缩短检测时间，减少样品需求量，从而显著提高检测效率，该方法也为农产品中其他霉菌毒素的同时检测，甚至霉菌毒素以外其它小分子物质的同时检测提供了借鉴。本专利技术是通过如下具体技术方案实现的：一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法，按照下述步骤进行：步骤1、发射绿色荧光的水溶性碲化镉量子点(记为gQDs)和发射红色荧光的水溶性碲化镉量子点(记为rQDs)的制备；步骤2、单分散SiO2纳米球的制备；步骤3、金包四氧化三铁壳-核磁性纳米球(记为MBs)的制备；步骤4、gQDs包覆的SiO2(记为SiO2@gQDs)和rQDs包覆的SiO2(记为SiO2@rQDs)杂化纳米球的制备：取步骤2制备的SiO2纳米球和含0.02MNaCl的聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)溶液于烧杯中混合均匀，磁力搅拌反应3h；产物经离心分离、洗涤后，制得PDDA修饰的SiO2(记为PDDA-SiO2)；然后，加入步骤1中制备的gQDs或rQDs水溶液，于避光条件下磁力搅拌反应3h，经离心分离、洗涤后，将产物分散到蒸馏水中，备用；步骤5、SiO2@gQDs标记的cDNA1(记为cDNA1-SiO2@gQDs)和SiO2@rQDs标记的cDNA2(记为cDNA2-SiO2@rQDs)信号探针的制备：取步骤4制备的SiO2@gQDs和SiO2@rQDs分别分散于离心管中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化交联溶液，振荡反应1h，随后分别加入cDNA1和cDNA2储备液，振荡孵育过夜，通过酰胺键将cDNA1和cDNA2分别藕联到SiO2@gQDs和SiO2@rQDs表面制备cDNA1-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：步骤1、发射绿色荧光的水溶性碲化镉量子点(记为gQDs)和发射红色荧光的水溶性碲化镉量子点(记为rQDs)的制备；步骤2、单分散SiO2纳米球的制备；步骤3、金包四氧化三铁壳‑核磁性纳米球(记为MBs)的制备；步骤4、gQDs包覆的SiO2(记为SiO2@gQDs)和rQDs包覆的SiO2(记为SiO2@rQDs)杂化纳米球的制备：取步骤2制备的SiO2纳米球和含0.02M NaCl的聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)溶液于烧杯中混合均匀，磁力搅拌反应3h；产物经离心分离、洗涤后，制得PDDA修饰的SiO2(简称为PDDA‑SiO2)；然后，加入步骤1中制备的gQDs或rQDs水溶液，于避光条件下磁力搅拌反应3h，经离心分离、洗涤后，将产物分散到蒸馏水中，备用；步骤5、SiO2@gQDs标记的cDNA1(记为cDNA1‑SiO2@gQDs)和SiO2@rQDs标记的cDNA2(简称为cDNA2‑SiO2@rQDs)信号探针的制备：取步骤4制备的SiO2@gQDs和SiO2@rQDs分别分散于离心管中，加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N‑羟基丁二酰亚胺(NHS)活化交联溶液，振荡反应1h，随后分别加入cDNA1和cDNA2储备液，振荡孵育过夜，通过酰胺键将cDNA1和cDNA2分别藕联到SiO2@gQDs和SiO2@rQDs表面制备cDNA1‑SiO2@gQDs和cDNA2‑SiO2@rQDs信号探针，离心洗涤后，将其重新分散在Tris‑HCl(pH 7.4，10mM)溶液中，备用；步骤6、MBs标记的Apt1(记为MBs‑Apt1)和MBs标记的Apt2(记为MBs‑Apt2)磁性捕获探针的制备：取步骤3制备的MBs的分散液于离心管中，加入aptamer，振荡孵育过夜，通过Au‑S键将Apt1和Apt2分别藕联到MBs表面制备MBs‑Apt1和MBs‑Apt2磁性捕获探针，离心洗涤后，将其重新分散在Tris‑HCl(pH 7.4，10mM)溶液中，备用；步骤7、传感器的构建及样品的检测，包括：纳米生物复合物的制备：取步骤5制备的cDNA1‑SiO2@gQDs信号探针和步骤6制备的MBs‑Apt1磁性捕获探针于离心管中混合，同样，取步骤5制备的cDNA2‑SiO2@rQDs信号探针和步骤6制备的MBs‑Apt2磁性捕获探针于另外一支离心管中，混合37℃振荡孵育2h，基于Aptamer和cDNA之间的杂交反应分别制得纳米生物复合物1(记为MBs‑Apt1/cDNA1‑SiO2@gQDs)和纳米生物复合物2(记为MBs‑Apt2/cDNA2‑SiO2@rQDs)，磁控分离、洗涤后，将其重新分散在Tris‑HCl缓冲溶液(pH 7.4，10mM，含120mM NaCl，20mM CaCl2，20mM MgCl2和5mM KCl)中，备用；对OTA和AFB1标准品进行同时检测，建立标准曲线：取所制备的MBs‑Apt1/cDNA1‑SiO2@gQDs和MBs‑Apt2/cDNA2‑SiO2@rQDs纳米生物复合物各400μL进行等量混合，然后，加入100μL包含不同浓度OTA和AFB1的混合溶液于离心管中，37℃振荡孵育40min；由于OTA与Apt1之间以及AFB1与Apt2之间的特异性结合，使得部分cDNA1‑SiO2@gQDs和cDNA2‑SiO2@rQDs信号探针分别从MBs‑Apt1/cDNA1‑SiO2@gQDs和MBs‑Apt2/cDNA2‑SiO2@rQDs纳米生物复合物上脱附；经磁分离后，收集已脱附的cDNA1‑SiO2@gQDs和cDNA2‑SiO2@rQDs，设置激发波长为365nm，扫描得到荧光谱图；通过荧光强度与OTA和AFB1标准品浓度之间的对应关系建立标准曲线。...

【技术特征摘要】
1.一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：步骤1、发射绿色荧光的水溶性碲化镉量子点(记为gQDs)和发射红色荧光的水溶性碲化镉量子点(记为rQDs)的制备；步骤2、单分散SiO2纳米球的制备；步骤3、金包四氧化三铁壳-核磁性纳米球(记为MBs)的制备；步骤4、gQDs包覆的SiO2(记为SiO2@gQDs)和rQDs包覆的SiO2(记为SiO2@rQDs)杂化纳米球的制备：取步骤2制备的SiO2纳米球和含0.02MNaCl的聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)溶液于烧杯中混合均匀，磁力搅拌反应3h；产物经离心分离、洗涤后，制得PDDA修饰的SiO2(简称为PDDA-SiO2)；然后，加入步骤1中制备的gQDs或rQDs水溶液，于避光条件下磁力搅拌反应3h，经离心分离、洗涤后，将产物分散到蒸馏水中，备用；步骤5、SiO2@gQDs标记的cDNA1(记为cDNA1-SiO2@gQDs)和SiO2@rQDs标记的cDNA2(简称为cDNA2-SiO2@rQDs)信号探针的制备：取步骤4制备的SiO2@gQDs和SiO2@rQDs分别分散于离心管中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化交联溶液，振荡反应1h，随后分别加入cDNA1和cDNA2储备液，振荡孵育过夜，通过酰胺键将cDNA1和cDNA2分别藕联到SiO2@gQDs和SiO2@rQDs表面制备cDNA1-SiO2@gQDs和cDNA2-SiO2@rQDs信号探针，离心洗涤后，将其重新分散在Tris-HCl(pH7.4，10mM)溶液中，备用；步骤6、MBs标记的Apt1(记为MBs-Apt1)和MBs标记的Apt2(记为MBs-Apt2)磁性捕获探针的制备：取步骤3制备的MBs的分散液于离心管中，加入aptamer，振荡孵育过夜，通过Au-S键将Apt1和Apt2分别藕联到MBs表面制备MBs-Apt1和MBs-Apt2磁性捕获探针，离心洗涤后，将其重新分散在Tris-HCl(pH7.4，10mM)溶液中，备用；步骤7、传感器的构建及样品的检测，包括：纳米生物复合物的制备：取步骤5制备的cDNA1-SiO2@gQDs信号探针和步骤6制备的MBs-Apt1磁性捕获探针于离心管中混合，同样，取步骤5制备的cDNA2-SiO2@rQDs信号探针和步骤6制备的MBs-Apt2磁性捕获探针于另外一支离心管中，混合37℃振荡孵育2h，基于Aptamer和cDNA之间的杂交反应分别制得纳米生物复合物1(记为MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs)和纳米生物复合物2(记为MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs)，磁控分离、洗涤后，将其重新分散在Tris-HCl缓冲溶液(pH7.4，10mM，含120mMNaCl，20mMCaCl2，20mMMgCl2和5mMKCl)中，备用；对OTA和AFB1标准品进行同时检测，建立标准曲线：取所制备的MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs和MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs纳米生物复合物各400μL进行等量混合，然后，加入100μL包含不同浓度OTA和AFB1的混合溶液于离心管中，37℃振荡孵育40min；由于OTA与Apt1之间以及AFB1与Apt2之间的特异性结合，使得部分cDNA1-SiO2@gQDs和cDNA2-SiO2@rQDs信号探针分别从MBs-Apt1/cDNA1-SiO2@gQDs和MBs-Apt2/cDNA2-SiO2@rQDs纳米生物复合物上脱附；经磁分离后，收集已脱附的cDNA1-SiO2@gQDs和cDNA2-SiO2@rQDs，设置激发波长为365nm，扫描得到荧光谱图；通过荧光强度与OTA和AFB1标准品浓度之间的对应关系建立标准曲线。2.根据权利要求1所述的一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法，其特征在于步骤1中，gQDs的制备方法为：称取碲粉和硼氢化钠置入10mL比色管中，加入超纯水，通N2除氧15min后置于4℃冰箱中反应得到上清液呈淡紫色透明的碲氢化钠(NaHTe)溶液；将氯化镉水合物(CdCl2·2.5H2O)和巯基丙酸加入到含二次水的三颈烧瓶中，氮气氛围下磁力搅拌15min，用1MNaOH调节溶液pH至8.5左右，迅速加入上述制备的NaHTe溶液，继续搅拌30min，100℃下回流0.5h，得到gQDs；停止反应恢复至室温，加入过量乙醇搅拌然后静置15min，离心后，将沉淀物重新分散得到10mL水中得到的gQDs水溶液，4℃避光保存；rQDs的制备方法为：称取碲粉和硼氢化钠置入10mL比色管中，加入超纯水，通N2除氧15min后置于4℃冰箱中反应得到上清液呈淡紫色透明的碲氢化钠(NaHTe)溶液；将CdCl2·2.5H2O和巯基丙酸加入到含二次水的三颈烧瓶中，氮气氛围下磁力搅拌15min，用1MNaOH调节溶液pH至8.5左右，迅速加入上述制备的NaHTe溶液，继续搅拌30min，100℃下回流12h，得到rQDs；停止反应恢复至室温，加入过量乙醇搅拌然后静置15min，离心后，将沉淀物重新分散得到10mL水中得到的rQDs水溶液，4℃避光保存；步骤1中，在gQDs的制备过程中，所述碲粉、硼氢化钠和超纯水的质量比为1.5:1:89；反应混合溶液中Cd:Te:MPA的摩尔比为1:1:2.5；在rQDs的制备过程中，所述碲粉、硼氢化钠和超纯水的质量比为1.5:1:89；反应混合溶液中Cd:Te:MPA的摩尔比为1:1:2.5。3.根据权利要求1所述的一种用于两种霉菌毒素同时检测的适配体传感器制备方法，其特征在于步骤2中，单分散SiO2纳米球的制备方法为：取一个经过严格清洗的250mL单口烧瓶...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱静，袁瑞霜，任婵婵，王成全，王坤，李华明，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32