一种快速判断酿酒窖泥品质的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，通过对品质稳定的优、劣窖泥进行16S rDNA高通量测序与特异性引物检测，发现克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌这两种与窖泥品质正相关的指针性微生物。利用特异性引物对窖泥中的克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的含量进行检测，继而判断窖泥质量，其结果与用传统方法判断窖泥品质的结果高度一致。本发明专利技术可用于酿酒窖泥品质监测和窖泥的维护、优化领域。

A quick method to judge the quality of the wine cellar mud

The invention discloses a method to quickly judge the quality of the wine cellar mud. Through high quality 16S rDNA sequencing and specific primer detection for the stable and inferior pit mud with stable quality, two kinds of needle like microbes which are positively related to the quality of the pit mud are found by the high quality sequencing and specific primer detection. Specific primers were used to detect the content of Clostridium Clostridium and monomonas sp. Waugh in pit mud, and then the quality of pit mud was judged. The results were in good agreement with the results of using traditional methods to judge the quality of pit mud. The invention can be used for the quality monitoring of cellar mud and the maintenance and optimization of pit mud.

【技术实现步骤摘要】
一种快速判断酿酒窖泥品质的方法
本专利技术涉及窖泥检测方法，具体是一种快速判断酿酒窖泥品质的方法。
技术介绍
浓香型白酒是中国白酒的代表酒种，也是中国产销量最大的白酒。窖泥是浓香型白酒酿造的基础，其品质的优劣直接影响所产基酒的质量。生产中常常需要对窖泥品质进行监测，以便及时维护、提高窖泥品质。因此，对窖泥品质进行及时、正确的判断，在生产中具有重要意义。在窖泥品质的判断方面，目前常用的判断标准仍然是感官指标，通过对窖泥的颜色、气味、手感及质地等进行人为判断。劣质窖泥常含有白色颗粒或晶体，而且酯香味较弱；优质窖泥呈灰黑色并具有较浓的酯香味，有时会有臭鸡蛋气味。但感官判断对经验的要求较高，且人的主观因素影响较大。部分专利给出了窖泥质量的量化评价标准，如专利CN201310051543.1，但该专利评价指标较多，且人的主观因素仍然影响较大；专利CN201410782176.7以所酿白酒的品质来判断窖泥的品质，但由于影响酿酒品质的因素是多样的，且需较长周期，在及时性上有所不足。窖泥中微生物类群非常复杂，栖息着大量窖泥功能菌，对浓香型白酒的风格形成具有十分重要的作用，其种类和丰度也是衡量窖泥品质的一个重要指标。近年来随着微生物检测技术的发展，使利用微生物技术来研究窖泥微生物组成、判断窖泥品质成为新的研究方向，如专利CN201010537999.5利用变性梯度凝胶电泳技术分析窖泥微生物菌群组成，专利CN201410119217.4提供了窖泥中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌、甲烷菌的定量分析方法。但它们都侧重于提供一些检测方法，没有建立利用指针性微生物快速判断窖泥品质的方法，且它们所建立的检测方法对人员和设备的要求较高，在酒厂应用将面临较大的困难。专利CN201710259131.5利用高通量测序方法，发现了乳酸杆菌在窖泥中的分布规律，并利用乳酸杆菌的丰度判断窖泥质量。然而，这种方法所需成本较高，周期较长，且只有乳酸杆菌这一个指标，导致实际应用中仍然面临诸多问题。因此，需要开发新型、快速、可靠的判断窖泥品质的方法。鉴于微生物菌群结构与窖泥品质密切相关，通过对窖泥微生物菌群结构的分析，有可能发现与窖泥品质密切相关的指针性微生物，基于对这些指针性微生物的检测，有望建立快速判断窖泥品质的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，以解决现有技术在窖泥检测方面存在易受人主观因素影响、准确性差的问题。为了达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：以窖泥中的克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的浓度对窖泥品质进行判断，克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的浓度与窖泥品质正相关。所述的一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)、首先提取待测的窖泥样品中的微生物基因组总DNA；(2)、其次利用克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的特异性引物，对微生物基因组总DNA中属于克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；(3)、接着采用凝胶电泳检测的方法检测PCR扩增后的扩增产物，并观察电泳检测结果；(4)、然后对凝胶电泳检测结果进行定量分析，获取克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的DNA浓度；(5)、最后根据克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的DNA浓度判断窖泥品质，优质窖泥中克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的DNA浓度比劣质窖泥高。所述的一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：步骤(1)中，使用MOBIO强力土壤DNA提取试剂盒对待测的窖泥样品的微生物基因组总DNA进行提取。所述的一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：步骤(2)中，克氏梭状芽孢杆菌的特异性引物为：Clo-F(5’-GAGGAGCAAATCTCAAAAACTGC-3’)、Clo-R(5’-CCTCCTTGGTTAGACTACGGACTT-3’)；沃氏互营单胞菌的特异性引物为：Syn-F(5’-TTCCGGTCGGGTTTTACAGG-3’)、Syn-R(5’-GCTGCCATCGAGCCTATCTT-3’)。所述的一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：步骤(2)中，进行PCR扩增时，PCR反应体系中各组分及各组分的体积如下：所述的一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：步骤(2)中，进行PCR扩增时，PCR扩增程序为：95℃10min；94℃1min，60℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。所述的一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：步骤(3)中，利用凝胶成像仪观察到较亮的目标条带，即为凝胶电泳检测结果。所述的一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：步骤(4)中，通过软件GelAnalysis对凝胶电泳检测结果进行定量分析，获取克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的DNA浓度。本专利技术的优点1、相较于传统的窖泥感官判断方法，本专利技术无需特别依赖经验，并且可排除人主观因素的影响，具有较好的科学性。2、本专利技术利用两种微生物指标进行窖泥品质判断，相比于利用单一微生物指标对窖泥品质的判断，该方法准确性更高。3、本专利技术发掘的两种指针性微生物不仅可以用来鉴定窖泥品质，也为将来通过添加指针性微生物改善窖泥品质提供了理论依据。因此，本专利技术在窖泥的维护、优化方面具有重要意义。附图说明图1为利用克氏梭状芽孢杆菌特异性引物对优、劣窖泥样品进行PCR检测。图1中：A，PCR扩增产物的凝胶成像结果。M，DNAmarker5000；L1-L3，劣质窖泥；H1-H3，优质窖泥；CK，阴性对照。B，目标条带DNA浓度。DNA浓度计算时扣除背景(CK)值，且每个样品所对应的DNA浓度为三组实验的平均值。图2利用沃氏互营单胞菌特异性引物对优、劣窖泥样品进行PCR检测。图2中：A，PCR扩增产物的凝胶成像结果。M，DNAmarker5000；L1-L3，劣质窖泥；H1-H3，优质窖泥；CK，阴性对照。B，目标条带DNA浓度。DNA浓度计算时扣除背景(CK)值，且每个样品所对应的DNA浓度为三组实验的平均值。图3利用克氏梭状芽孢杆菌特异性引物对20组窖泥样品进行PCR检测。图3中：A，PCR扩增产物的凝胶成像结果。M，DNAmarker5000；1-10，劣质窖泥；11-20，优质窖泥；CK，阴性对照。B，目标条带DNA浓度。DNA浓度计算时扣除背景(CK)值，且每个样品所对应的DNA浓度为三组实验的平均值。图4利用沃氏互营单胞菌特异性引物对20组窖泥样品进行PCR检测。图4中：A，PCR扩增产物的凝胶成像结果。M，DNAmarker5000；1-10，劣质窖泥；11-20，优质窖泥；CK，阴性对照。B，目标条带DNA浓度。DNA浓度计算时扣除背景(CK)值，且每个样品所对应的DNA浓度为三组实验的平均值。具体实施方式实施例1两种指针性微生物克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的发掘1.样品采集窖泥样品采集于某大型知名酿酒公司，且选取品质稳定的优、劣窖泥。窖泥质量根据其感官特征和长期酿酒结果进行判定：优质窖泥呈灰黑色、酯香浓郁、有硫化氢气味、湿润、柔软、质地均匀，长期酿酒效益较好(表1)；劣质窖泥呈银灰色、有白色团块或针状结晶、酯香味淡，长期酿酒效益较差(表1)。窖泥样品采本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：以窖泥中的克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的浓度对窖泥品质进行判断，克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的浓度与窖泥品质正相关。

【技术特征摘要】
1.一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：以窖泥中的克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的浓度对窖泥品质进行判断，克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的浓度与窖泥品质正相关。2.根据权利要求1所述的一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）、首先提取待测的窖泥样品中的微生物基因组总DNA；（2）、其次利用克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的特异性引物，对微生物基因组总DNA中属于克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；（3）、接着采用凝胶电泳检测的方法检测PCR扩增后的扩增产物，并观察电泳检测结果；（4）、然后对凝胶电泳检测结果进行定量分析，获取克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的DNA浓度；（5）、最后根据克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的DNA浓度判断窖泥品质，优质窖泥中克氏梭状芽孢杆菌和沃氏互营单胞菌的DNA浓度比劣质窖泥高。3.根据权利要求2所述的一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：步骤（1）中，使用MOBIO强力土壤DNA提取试剂盒对待测的窖泥样品的微生物基因组总DNA进行提取。4.根据权利要求2所述的一种快速判断酿酒窖泥品质的方法，其特征在于：步骤（2）中，克氏梭状芽孢杆菌的特异性引物为：Clo-F(5’-GAGGAGCAAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪焰胜，张部昌，李彬，董宏，陈兴杰，杨牢记，郝标，黄训端，陈瑞玉，
申请(专利权)人：安徽金种子酒业股份有限公司，安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34