一种靶向抑制血小板聚集的抗栓小肽ωKWR制造技术

本发明专利技术提供了一种小分子多肽，对RWR五肽进行改造。RWR是根据RGD特异结合αIIbβ3的特点，在其N端增加疏水性氨基酸和碱性氨基酸，第四位增加一个疏水性氨基酸W，第五位增加一个碱性氨基酸R，该小肽序列为Arg‑Gly‑Asp‑Trp‑Arg，其蛋白质一级结构为RGDWR，可提高其特异结合αIIbβ3能力，又能以较小的分子量降低了免疫原性，但其稳定性较差。本发明专利技术拟对RWR进行结构改造，在RWR的氨基端融合了一个稳定性基团w‑氨基辛酸，将第一位氨基酸R变为K，将W和D位置互换，设计合成一种新的靶向识别αIIbβ3的小肽ω‑KGWDR，其一级结构为H2N(CH2)7‑CO‑Lys‑Gly‑Trp‑Asp‑Arg，实验证明稳定性基团的引入，极大的提高了小肽的稳定性，R变为K后，其活性得到了进一步增强，有效解决了RWR作为抗血栓制剂不稳定的问题。

A small antithrombin peptide Omega KWR targeting platelet aggregation

The invention provides a small molecular polypeptide to transform the RWR five peptide. RWR is based on the specific binding of RGD to alpha IIb beta 3, the addition of hydrophobic amino acids and alkaline amino acids at the N end, the fourth potential to increase a hydrophobic amino acid W, and the fifth to increase the R of an alkaline amino acid. The peptide sequence is Arg Gly Asp Trp Arg, and its first stage structure is RGDWR, which can improve its specific binding to alpha beta. 3, the ability to reduce the immunogenicity was reduced by a small molecular weight, but its stability was poor. In this invention, the structure of RWR is reconstructed, and a stable group of W, w amino octanoic acid, is fused at the amino end of RWR, the first amino acid R is transformed into K, W and D position is exchanged, and a new small peptide KGWDR, a new target identifying alpha IIb beta 3, is designed and synthesized. The first order structure is H2N (CH2) 7 It was proved that the stability of the stable group greatly improved the stability of the small peptide. After R became K, its activity was further enhanced, which effectively solved the problem of the instability of RWR as an antithrombotic agent.

【技术实现步骤摘要】
一种靶向抑制血小板聚集的抗栓小肽ωKWR
本专利技术涉及蛋白质多肽领域，具体地讲，涉及一种更加稳定的、活性更高的靶向识别血小板表面整合素αIIbβ3的小肽的制备及用途。
技术介绍
心脑血管疾病如心肌梗死、脑梗塞是一种严重威胁人类健康的重大疾病，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人以上，且呈现逐年递增和年轻化的趋势。心脑血管疾病“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高、并发症多”（四高一多）的特点，已成为人类健康的主要威胁，其发生发展与动脉粥样斑块破裂、血栓形成及血栓栓塞等因素密切相关。因此，抗栓药物成为防治心血管疾病的重要基石。抗栓是治疗各种血栓栓塞性疾病的核心，了解各类抗栓药物的作用机制以及新型抗栓药物的特点才能更好地预防和治疗心血管疾病。目前用于临床的血栓抑制剂有很多种。1、一些溶栓药物如溶栓药尿激酶、链激酶，TPA等具有一定的溶解血栓作用，尤其在短时间内介入治疗无法实施的情况下，溶栓治疗能尽早地开放血管，使缺血心肌更早得到再灌注，从而减少梗死面积、改善患者预后。但溶栓治疗后早期和持续开通率相对冠脉介入治疗低，90分钟梗死相关血管的开通率为40%〜85%，溶栓后90分钟内梗死相关血管向前血流达TIMIG3级者约占20%〜60%。另外，溶栓治疗的出血的并发症是个不可忽视的问题；2、目前常用的抗血小板药物包括环氧酶抑制药，以阿司匹林（缺点是出血、胃肠道反应和变态反应）为主要代表，通过肠道可以完全吸收；ADP受体拮抗药：如氯吡格雷（缺点是出血和胃肠道反应）和替格瑞洛（缺点是呼吸困难和皮下出血）；血小板αIIbβ3受体拮抗药：如阿昔单抗和替罗非班，目前是最强的抗血小板药物（一般只能从静脉或冠状动脉给药）；3、抗凝药物：可以从各个途径阻断凝血途径，用于预防和治疗各种静脉和动脉血栓，代表性药物有华法林（缺点是治疗窗狭窄、需定期检测INR）和肝素（有诱发血小板减少的风险），肝素钠（容易导致出血、血小板减少和骨质疏松）；4、口服抗凝药近年来，起效快、安全性高、无需常规监测的新型口服抗凝药物不断涌现，为临床提供了更为有效、方便、安全的选择。如达比加群酯（缺点是缺乏特异拮抗药，影响肾功能），利伐沙班（缺点是缺乏特异拮抗药，影响肝功能）和阿哌沙班（治疗窗狭窄）。前面提到的多数抗栓药物普遍在临床得以应用，都或多或少存在用药量大，停药易反复、价格昂贵及需要多次给药的缺点，特别是除了血小板αIIbβ3受体拮抗药（阿昔单抗和替罗非班）外，多数的抗血小板聚集药只能阻止血小板活化途径中的一条通路，当某一特定通路被充分抑制时，血小板仍可通过其它途径活化，引起血小板聚集。血栓形成的共同通路也即关键环节是：血小板活化后，表面膜受体发生构象改变，αIIbβ3受体暴露，纤维蛋白RGD序列被αIIbβ3受体特异性识别，介导纤维蛋白与血小板的结合，该过程犹如链条把相邻血小板聚在一起形成血栓，正是由于RGD序列与αIIbβ3受体的特异性结合，因此含有RGD序列的多肽即可以竞争性抑制纤维蛋白与血小板的结合，从而抑制血栓形成，即可以阻断血栓形成的最后通路。RGD是精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸组成的三肽。1984年Pierschbacher和Ruoslahti首次确定了RGD序列为人纤维连接蛋白与其受体结合位点。研究发现：RGD广泛存在于细胞识别系统。基质蛋白中的RGD是与细胞表面特异受体相互作用的识别位点，这些细胞表面膜蛋白是广泛分布的超级家族—粘附受体的成员，称为整合素。整合素在正常情况下无活性，一旦在激素，细胞因子或其它因素的刺激下，其构型和亲合力发生改变，整合素受体与特异性配体的RGD结构结合，引起细胞内一系列生化改变，进而影响多种组织细胞功能的调控，包括细胞凋亡，分化，增殖，迁移，粘附，血小板聚集等一系列病理生理过程。国内外对RGD多肽的生物学活性进行的大量研究，证明了RGD多肽在疾病治疗方面具有广阔的应用前景。RGD及类似物对预防和治疗心脑血管疾病、骨质疏松以及由细胞粘连异常而导致的肿瘤等疾病具有重要作用，人工合成的RGD多肽或化合物也具有类似的生物学活性，含有RGD多肽已成为医学研究的热点。1991年J.Samanen等合成了一系列含有RGD序列的小肽，经过药理活性试验发现了它们可抑制纤维蛋白原与血小板的结合，抑制血栓的形成。众多实验研究表明，RGD多肽作为αIIbβ3受体拮抗剂,可以阻断血栓形成的最终通路，理论上具有彻底抑制血栓形成的功能。目前一些科学家已通过人工合成一些RGD序列的小肽进行基础及临床试验，并取得一定成果。如RGDS，DRGDW，GRGDSPA等都可抑制纤维蛋白与血小板结合，抑制血栓形成。研究表明，通过改变RGD周边氨基酸或结构能改变与血小板αIIbβ3结合的特性，用Val取代Arg将使RGD的活性降低10倍，用Ala取代Gly出现类似结果，用Glu取代Asp将使其功能完全丧失。逆转RGDS和RGDV序列将使其对血小板抑制功能完全丧失。另有实验研究表明：GRGDSP六肽（Gvy-Ay-Gy-Asy-Ser-Pro）可直接抑制纤维蛋白（Fg）与血小板的结合；Eward等发现RGDS明显抑制Fg和ADP激活的血小板结合；Rote等发现含RGD序列的SC-4992呈量依赖地抑制血栓形成，抑制ADP和花生四烯酸引起的血小板聚集。天然存在的含RGD的多肽和人工合成含RGD的小肽，一般都具有相似的功能，既可以抑制血栓形成、也具有抑制肿瘤转移和骨质疏松的功能，因此，RGD类似物作用广泛但不特异，如何提高其作用的特异性和活性是研究人员的关注热点，也是我们多年来的研究重点。近年来，我们通过突变EchistatinRGD模体周边部分氨基酸，得到两种不同的突变体。建立了这两种突变体的基因工程生产工艺，通过药效学研究RGD周边氨基酸的变化对其活性的影响，在RGD模体周边氨基酸突变研究方面积累了一定的经验。研究表明，第四位氨基酸对其活性影响最大，以疏水氨基酸为佳，疏水性越强，其抑制纤维蛋白与αIIbβ3结合力越强。在RGD基础上，增加一个疏水性氨基酸和一个碱性氨基酸，序列为Arg-Gly-Asp-Trp-Arg（命名为RWR）。在后来在药代动力学研究中发现，RWR性质不稳定，半衰期很短，非常容易降解，如果应用到临床，就需要多次大剂量给药，给临床用药造成一定的麻烦，还可能引起一些副作用，为了提高其稳定性，我们在RWR氨基端增加ω-氨基辛酸，结构式为H2N(CH2)7-CO-Arg-Gly-Asp-Trp-Arg，并将其命名为ωRWR。又根据去整合素Barbourin含有KGD(Lys-Gly-Asp)而不是RGD更倾向于结合αIIbβ3，但对αvβ3，α5β1结合能力较弱，可能由于R、K侧链基团的不同，引起对不同整合素的识别特异性不同，并且根据RGD环较宽时，对αIIbβ3的结合能力增强的特点，将ωRWR中的第一个R突变为K，将Asp和Trp互换，形成一种新的小肽ωKWR，其一级结构为式为H2N(CH2)7-CO-Lys-Gly-Trp-Asp-Arg。本专利技术的目的，在于提供一种能够高效、特异识别和抑制血栓形成的多肽，特别是理化性质非常稳定，从而克服现有血栓生成抑制剂及一些溶栓药物存在的副作用大、特异性不强，特别是解决了小肽稳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小分子多肽ωKWR，其蛋白质一级结构为H2N(CH2)7‑CO‑ Lys ‑Gly‑ Trp‑ Asp ‑Arg。

【技术特征摘要】
1.一种小分子多肽ωKWR，其蛋白质一级结构为H2N(CH2)7-CO-Lys-Gly-Trp-Asp-Arg。2.制备权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨利军，张明升，杨涛，郑海锋，孙海飚，徐勇，王宇涛，闫丽红，张利桃，卢培芬，陈俊俊，代洁，章毅，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：山西,14