一种检测LRP2基因SNP位点rs2544390基因型的方法技术

本发明专利技术提供一种检测LRP2基因SNP位点rs2544390基因型的方法，步骤如下：构建重组阴性质粒和重组阳性质粒；提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型。本发明专利技术的方法能够准确检测LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型，灵敏度高，特异性好，检测迅速；应用本发明专利技术的方法对LRP2基因SNP位点rs2544390基因型的分型与测序结果完全一致，能够用于痛风易患性的辅助判断。

A method for detecting rs2544390 genotype of SNP locus in LRP2 gene

The present invention provides a method for detecting the rs2544390 genotype of the SNP locus of LRP2 gene. The steps are as follows: constructing a recombinant negative plasmid and a recombinant positive plasmid, extracting the genomic DNA of the peripheral blood of the samples to be measured, using PCR amplification and HRM analysis for the recombinant negative plasmids, recombinant positive plasmids and the DNA of the samples to be measured, and collecting the data; According to the collected data, the high resolution fusion curve was plotted and the genotype of the SNP locus rs2544390 of the LRP2 gene was determined according to the fusion curve of the recombinant negative plasmids and recombinant positive plasmids. The method of the invention can accurately detect the genotype of the SNP locus rs2544390 of the LRP2 gene, with high sensitivity, good specificity and rapid detection. The typing of the rs2544390 genotype of the SNP locus of the LRP2 gene is in full agreement with the sequencing results, and can be used for the auxiliary judgment of gout susceptibility.

【技术实现步骤摘要】
一种检测LRP2基因SNP位点rs2544390基因型的方法
本专利技术涉及一种检测LRP2基因rs2544390基因型的方法。
技术介绍
痛风(Gout)是由嘌呤代谢紊乱和肾小管源性的尿酸排泄障碍而引起关节及某些器官损害的一种代谢疾病。近年我国发病率快速增长，年轻化趋势明显，现症患者达1.2亿人以上，其中痛风3000万以上。遗传和环境多因素致病机制未完全明了，至今95％以上患者未能达标治疗。痛风早期的临床表现为间断发作性急性关节炎，主要为单关节受累，肿痛一般持续7-10天，可通过药物或自发缓解，间歇期无症状。随着病程的延长，痛风发作次数、受累关节数逐渐增加，间歇期也开始出现症状，同时关节或皮肤软组织中痛风石形成，严重者出现关节毁损或致残，出现肾脏结石、慢性肾损伤等，最终可能发展成慢性肾功能衰竭。高血酸尿症(Hyperuricemia，HUA)、饮酒、代谢综合征、高血压、肥胖、利尿剂的服用等危险因素都与痛风的发生发展有关。目前关于痛风的发病机制尚不清楚，但大量研究表明是痛风是一种由环境和遗传因素共同作用引起的多基因遗传病，目前已知的痛风相关基因有ABCG2、IRGM等。研究发现高血酸尿症人群中仅有10％左右的人可能发展成痛风，说明不直接参与尿酸代谢的基因也可能与痛风易感性有关。鉴于痛风对患者引起的严重危害和沉重的负担，对痛风易感基因的筛查和研究日益受到人们的关注。人属低密度脂蛋白受体相关蛋白2(low-densitylipoproteinreceptor-relatedproteinLRP2)位于染色体4q22-q23，编码由655个氨基酸组成的跨膜蛋白，为ATP结合转运蛋白G超家族成员。LRP2分子是一种细胞表面蛋白，属于一种内吞性受体，是低密度脂蛋白受体(lowdensitylipoproteinreceptor，LDLR)基因家族七大成员之一。LRP2除了参与内吞作用外，还具有细胞信号传导功能。LRP2bp作为与LRP2结合的一种新型接头分子，可能通过与受体相互作用，招募各种蛋白分子形成蛋白复合体，介导受体参与信号转导。人低密度脂蛋白受体相蛋白2结合蛋白在各种组织和器官中广泛表达，在人子宫、睾丸、小肠、结肠、血液白细胞及人胰腺癌细胞系中表达水平较高。LRP2基因在肝脏和肾小管组织中表达，根据嘌呤降解途径在肝脏被激活或者肾小管的尿酸排泄减少推断出在摄入酒精的背景下LRP2基因突变影响尿酸水平。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种检测LRP2基因rs2544390基因型的方法。本专利技术还公开了用于扩增和检测样品LRP2基因SNPrs2544390的引物序列。本申请人设计了一种检测LRP2基因SNPrs2544390基因型的方法，用来检验LRP2基因SNPrs2544390的基因型，该结果可用于LRP2基因SNPrs2544390相关的痛风易患性风险评估。本专利技术的第一个目的是提供一种检测LRP2基因SNP位点rs2544390基因型的方法，步骤如下：(1)构建重组阴性质粒和重组阳性质粒：所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.2；(2)提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；作为优选，所述HRM分析的条件为：94℃90s；60℃30s；83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s；(3)根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型：与重组阴性质粒的熔解曲线重合则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为GG；与重组阳性质粒的熔解曲线重合则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为AA；在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为GA。作为优选，所述PCR扩增时所用引物为(1)-(3)中的一种：(1)上游引物：LRP2-F5'-GATGGGCACTCTGACGGT-3'下游引物：LRP2-R5'-GTTGTTGCAAGCCGAAGAGC-3'(2)与(1)中的互补序列；(3)将(1)中的序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。作为优选，所述PCR扩增时的反应体系为：作为优选，所述PCR扩增时的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s；40个循环。本专利技术的第二个目的是提供一种用于检测LRP2基因SNP位点rs2544390基因型的试剂盒，所述试剂盒包括重组阴性质粒、重组阳性质粒和用于扩增上述重组阴性质粒和重组阳性质粒的引物；所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.2。作为优选，所述引物为(1)-(3)中的一种：(1)上游引物：LRP2-F5'-GATGGGCACTCTGACGGT-3'下游引物：LRP2-R5'-GTTGTTGCAAGCCGAAGAGC-3'(2)与(1)中的互补序列；(3)将(1)中的序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。作为优选，所述PCR扩增时的反应体系为：作为优选，PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s；40个循环。本专利技术的第三个目的是提供上述试剂盒的使用方法，步骤如下：(1)提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的外周血基因组DNA均进行PCR扩增和HRM分析：所述HRM分析的条件为：94℃90s；60℃30s；83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s；(2)根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型：与重组阴性质粒的熔解曲线重合则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为GG；与重组阳性质粒的熔解曲线重合则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为AA；在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为GA。本专利技术的第四个目的是提供序列表中SEQIDNo.1和SEQIDNo.2在制备检测LRP2基因SNP位点rs2544390基因型的试剂盒中的应用。本专利技术的第五个目的是提供序列表中SEQIDNo.1、序列表中SEQIDNo.2、权利要求5-8任一所述的试剂盒在制备辅助评估痛风易患性试剂中的应用。本专利技术的方法能够准确检测LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型，灵敏度高，特异性好，检测迅速；应用本专利技术的方法对LRP2基因SNP位点rs2544390基因型的分型与测序结果完全一致，能够用于痛风易患性的辅助判断。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为本专利技术的HRM方法灵敏度实验结果。图2为本专利技术的方法特异性实验结果。图3为样本用本专利技术的HRM方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测LRP2基因SNP位点rs2544390基因型的方法，其特征在于：步骤如下：(1)构建重组阴性质粒和重组阳性质粒：所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2；(2)提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；作为优选，所述HRM分析的条件为：94℃90s；60℃30s；83‑94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s；(3)根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型：与重组阴性质粒的熔解曲线重合则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为GG；与重组阳性质粒的熔解曲线重合则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为AA；在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为GA。

【技术特征摘要】
1.一种检测LRP2基因SNP位点rs2544390基因型的方法，其特征在于：步骤如下：(1)构建重组阴性质粒和重组阳性质粒：所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.2；(2)提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；作为优选，所述HRM分析的条件为：94℃90s；60℃30s；83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s；(3)根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型：与重组阴性质粒的熔解曲线重合则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为GG；与重组阳性质粒的熔解曲线重合则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为AA；在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则LRP2基因SNP位点rs2544390的基因型为GA。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增时所用引物为(1)-(3)中的一种：(1)上游引物：LRP2-F5'-GATGGGCACTCTGACGGT-3'下游引物：LRP2-R5'-GTTGTTGCAAGCCGAAGAGC-3'(2)与(1)中的互补序列；(3)将(1)中的序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增时的反应体系为：4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增时的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s；40个循环。5.一种用于检测LRP2基因SNP位点rs2544390基因型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括重组阴性质粒、重组阳性质粒和用于扩增上述重组阴性质...

【专利技术属性】
技术研发人员：车团结，徐红，陈游，杨震，李亚鹏，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32