一种人Tscm细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物免疫学领域，具体涉及一种人Tscm细胞及其制备方法和用途，所述制备方法包括以下步骤：(1)采集人脐带血，采用密度梯度离心法获得人脐带血单个核细胞；(2)采用流式细胞分选仪分选CD8+CD45RA+CCR7+初始T细胞亚群；(3)将分选的初始T细胞亚群加入含有刺激剂CD3/CD28 beads、细胞因子IL‑2和二甲双胍(metformin)的培养基中培养；(4)每隔2d进行换液并补加细胞因子IL‑2，扩增至14d时即可获得具有Tscm表型的CD8+T细胞。本发明专利技术的方法可以获得大量具有记忆特性同时分化状态低的T细胞用于肿瘤的治疗。

A human Tscm cell and its preparation and Application

The invention belongs to the field of biological immunology, in particular to a human Tscm cell and its preparation method and use. The preparation method comprises the following steps: (1) collecting human umbilical cord blood, obtaining human umbilical cord blood mononuclear cells by density gradient centrifugation, and (2) separating the initial T cell subgroup of CD8+CD45RA+CCR7+ by flow cytometry (3) the selected initial T cell subgroup was added into the medium containing the stimulant CD3/CD28 beads, the cytokine IL 2 and the metformin (metformin); (4) every 2D was exchanged and supplemented with the cytokine IL 2, and CD8+T cells with Tscm phenotype could be obtained when they were amplified to 14d. The method can obtain a large number of T cells with memory characteristics and low differentiation status for the treatment of tumors.

【技术实现步骤摘要】
一种人Tscm细胞及其制备方法和应用
本专利技术属于生物免疫学领域，具体涉及一种人Tscm细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
随着生物医学领域研究的不断深入，免疫学理论技术的日新月异，免疫治疗成为了人类战胜肿瘤的新希望。免疫活性细胞输注的过继免疫治疗作为免疫治疗的重要组成部分，是指将体外激活的免疫效应细胞输注给患者，以杀伤患者体内的肿瘤细胞。但该疗法在孕育希望的同时也面临着巨大的挑战：过继性细胞免疫治疗输注给患者的免疫细胞处于终末分化状态，在体内存活时间短，抗肿瘤效果受限。如何获得更多年轻化、持久稳定的抗肿瘤细胞，是目前免疫治疗研究的热点。CD8+记忆T细胞在抗肿瘤反应中发挥重要作用，分为不同的亚群即干细胞样T细胞(Tscm)、中心记忆性T细胞(Tcm)和效应记忆性T细胞(Tem)。其中Tscm亚群因其具有良好自我更新能力和多能性潜力且具有更强的杀伤肿瘤细胞的能力而备受关注。目前，国内外培养扩增Tscm细胞的方法并不能满足临床实际需求，一方面血液来源大多来自于患者或者患者亲属外周血，使得初始细胞的获取大大受限；另一方面，Tscm细胞在体外培养不宜稳定维持，容易进一步分化，使得培养所得Tscm细胞数目较少。因此，如何解决初始细胞的获取以及Tscm细胞的维持是目前Tscm体外培养的最大瓶颈。二甲双胍(metformin)是一种安全高效的双胍类降糖药，作为胰岛素增敏剂，metformin能够通过减少肝糖原异生，增加周围组织对胰岛素的敏感性、抑制肠道细胞吸收葡萄糖发挥降糖作用，有效降低血液胰岛素水平。同时，在细胞能量代谢研究中发现，二甲双胍是能量调控信号分子腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase，AMPK)的激动剂，激活AMPK负向调控下游哺乳动物雷帕霉素靶点(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)通路。
技术实现思路
本专利技术主要提供了一种人Tscm细胞及其制备方法和应用，可以获得大量具有记忆特性同时分化状态低的T细胞用于肿瘤的治疗。其技术方案如下：一种人Tscm细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)采集人脐带血，采用密度梯度离心法获得人脐带血单个核细胞；(2)采用流式细胞分选仪分选CD8+CD45RA+CCR7+初始T细胞亚群；(3)将分选的初始T细胞亚群加入含有刺激剂CD3/CD28beads、细胞因子IL-2和metformin的培养基中培养；(4)每隔2d进行换液并补加细胞因子IL-2，扩增至14d时即可获得具有Tscm表型的CD8+T细胞。优选的，步骤(1)中获得人脐带血单个核细胞具体的方法为，在无菌条件下采集人脐带血，先在1500rpm，10min条件下离心，将血清转移至无菌的离心管中56℃灭活25min，再4000rpm，20min离心血清，用缓冲液稀释沉淀的血细胞，然后将血细胞稀释液缓慢的加至淋巴分离液上，2500rpm，25min条件下离心，最后吸取白膜层，并用缓冲液清洗，1500rpm，10min离心，即获得人脐带血单个核细胞。优选的，所述缓冲液为PBS缓冲液，用缓冲液稀释沉淀的血细胞时，采用1/2-1/4血细胞量的PBS缓冲液稀释，所述淋巴分离液的体积量为血细胞稀释液体积量的1/2-1/4。优选的，步骤(2)中用流式细胞分选仪分选初始T细胞亚群具体的方法为，按照每2×106个单个核细胞避光加入1-3μL抗体，所述抗体为CD3-FITC、CD8-APC-cy-7、CD45RA-APC和CCR7-Percp，进行流式分选CD8+CD45RA+CCR7+初始T细胞。优选的，步骤(3)中刺激剂CD3/CD28beads的体积量为初始T细胞体积量的1/3，细胞因子IL-2的浓度为500-1000IU/mL，metformin的浓度为50-150μM。优选的，步骤(3)中所述培养基为TakaraGT-551培养基，培养条件为37℃、5％CO2环境。优选的，步骤(3)中所述培养基中还包括5％体积量的自体血清、青霉素和链霉素，培养基中T细胞密度为(1-3)×106/mL。优选的，扩增至14d时CD8+T细胞扩增倍数达180-220倍。一种人Tscm细胞，其由上述方法获得。所述的人Tscm细胞可以应用于治疗肿瘤疾病制剂中。采用上述方法制备人Tscm细胞，其具有以下优点：与传统的外周血获取初始免疫细胞相比，本专利技术方法中利用脐带血具有独特的优势：脐带血来源丰富，具有独特的生物、免疫学特性且含有大量的初始T细胞，更易诱导出干细胞样的T细胞，完美的解决了初始细胞获取难题；在体外实验中，我们首次研究发现，metformin能够激活T细胞的AMPK信号通路维持Tscm细胞的数目，并且抑制Tscm细胞的进一步分化，大大提高了Tscm细胞体外培养扩增的效率，在维持这群细胞自我更新能力以及多能潜性的同时也保留了Tscm细胞的高效抗肿瘤能力。从脐带血获得初始T细胞，加入CD3/CD28beads和IL-2诱导活化，并采用metfromin维持Tscm细胞的比例，从而获得大量具有记忆特性同时分化状态低的T细胞，从而获得抗肿瘤活性高、体内存活时间长的T细胞用于临床过继性细胞免疫治疗。本方法可使Tscm细胞的体外大量培养扩增，可以有效推动细胞免疫治疗的进一步发展，解决目前临床培养技术瓶颈，延长过继免疫细胞在患者体内存活时间，增强其持久高效的抗肿瘤能力，为细胞免疫治疗进一步开展大规模临床治疗打下坚实基础。附图说明图1为脐带血单个核细胞Tn细胞比例图；图2为成人外周血单个核细胞Tn细胞比例图；图3为脐带血单个核细胞和外周血单个核细胞Tn细胞统计图；图4为对比例1制备的Tscm细胞比例图；图5为实施例1制备的Tscm细胞比例图；图6为对比例1与实施例1制备的Tscm细胞比例的统计图；图7为流式检测对比例1中的方法杀伤性标记物CD107a的表达图；图8为流式检测实施例1中的方法杀伤性标记物CD107a的表达图；图9为对比例1与实施例1制备的Tscm细胞杀伤比例的统计图。具体实施方式实施例1无菌条件下采集脐带血50mL采用密度梯度离心法获得人脐带血单个核细胞CBMCs，具体步骤如下：先1500rpm，10min离心，其升速和减速的加速度均为9m/s2，将血清转移至无菌的50mL离心管中，56℃灭活25min，再4000rpm，20min离心血清，其升速和减速的加速度均为9m/s2。采用PBS缓冲液按照与血细胞量1:3的比例稀释沉淀的血细胞，然后将血细胞稀释液缓慢的加至淋巴分离液上，所述淋巴分离液的体积量为血细胞稀释液体积量的1/3。最后2500rpm，25min离心，其升速和减速的加速度均为5m/s2，小心吸取白膜层，用PBS缓冲液清洗两遍，1500rpm，10min离心，其升速和减速的加速度均为9m/s2，即可获得脐带血单个核细胞。将上述分离的CBMCs计数，按照每2×106个细胞避光加入2μL流式抗体，所述流式抗体为CD3-FITC、CD8-APC-cy-7、CD45RA-APC和CCR7-Percp，进行流式分选CD8+CD45RA+CCR7+T细胞。将分选的初始T细胞亚群置于含有1/3T细胞亚群体积量的刺激剂CD3/CD28beads和1000IU/mLIL-2的GT5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人Tscm细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)采集人脐带血，采用密度梯度离心法获得人脐带血单个核细胞；(2)采用流式细胞分选仪分选CD8+CD45RA+CCR7+初始T细胞亚群；(3)将分选的初始T细胞亚群加入含有刺激剂CD3/CD28beads、细胞因子IL‑2和metformin的培养基中培养；(4)每隔2d进行换液并补加细胞因子IL‑2，扩增至14d时即可获得具有Tscm表型的CD8+T细胞。

【技术特征摘要】
1.一种人Tscm细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)采集人脐带血，采用密度梯度离心法获得人脐带血单个核细胞；(2)采用流式细胞分选仪分选CD8+CD45RA+CCR7+初始T细胞亚群；(3)将分选的初始T细胞亚群加入含有刺激剂CD3/CD28beads、细胞因子IL-2和metformin的培养基中培养；(4)每隔2d进行换液并补加细胞因子IL-2，扩增至14d时即可获得具有Tscm表型的CD8+T细胞。2.根据权利要求1所述的人Tscm细胞的制备方法，其特征在于：步骤(1)中获得人脐带血单个核细胞具体的方法为，在无菌条件下采集人脐带血，先1500rpm，10min离心，将血清转移至无菌的离心管中55-57℃灭活20-30min，再4000rpm，20min离心血清，用缓冲液稀释沉淀的血细胞，然后将血细胞稀释液缓慢的加至淋巴分离液上，2500rpm，25min条件下离心，最后吸取白膜层，并用缓冲液清洗，1500rpm，10min离心，即获得人脐带血单个核细胞。3.根据权利要求2所述的人Tscm细胞的制备方法，其特征在于：所述缓冲液为PBS缓冲液，用缓冲液稀释沉淀的血细胞时，采用1/2-1/4血细胞量的PBS缓冲液稀释，所述淋巴分离液的体积量为血细胞稀释液体积量的1/2-1/4。4.根据权利要求1所述的人...

【专利技术属性】
技术研发人员：张毅，张震，张超奇，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：河南,41