再生毛囊原基的集合体的制造方法、含毛囊组织薄片及含毛囊组织薄片的制造方法技术

本发明专利技术提供一种简便地制造与哺乳动物的毛囊组织类似、规则且高密度的再生毛囊原基的集合体的方法。本发明专利技术的再生毛囊原基的集合体制造方法具备如下工序，即，在由规则配置的微小凹部构成的微凹板播种间充质细胞及上皮细胞，并在供给氧的同时进行混合培养，由此形成毛囊原基。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】再生毛囊原基的集合体的制造方法、含毛囊组织薄片及含毛囊组织薄片的制造方法
本专利技术涉及一种再生毛囊原基的集合体的制造方法、含毛囊组织薄片及含毛囊组织薄片的制造方法。本申请主张基于2015年10月30日在日本申请的专利申请2015-214547号的优先权，将其内容援用于此。
技术介绍
为了建立足够用于临床应用的毛囊再生医疗，需要再生毛囊具有正常的组织结构，并且形成并生长具有适于移植部位的毛干的毛。包含毛等皮肤附属器的胚层性附属器官通常在胎儿期通过上皮细胞及间充质细胞的相互作用而形成。已知作为外胚层性附属器官之一的毛囊在个体的生命过程中反复生长及衰退(毛发循环)，生长期中的毛球(hairbulb)部的再生通过与毛囊器官发生器相同的分子机制被诱导。并且，认为这种毛发循环中的毛球部的再生通过作为间充质细胞的毛乳头细胞被诱导。即，在生长期中，毛囊上皮干细胞通过作为间充质细胞的毛乳头细胞被分化诱导，由此毛球部得以再生。一直以来，针对毛囊再生，尝试了基于间充质细胞(毛乳头细胞及真皮毛根鞘细胞)的取代的毛囊可变区域的再生、基于具有毛囊诱导能力的间充质细胞的毛囊新生、或基于上皮细胞及间充质细胞的毛囊的重建等。具体而言，可举出：通过在凝胶内划分来配置上皮细胞及间充质细胞这2种细胞集合体，由此构筑毛囊原基，插入化学纤维等导件之后，将其移植，由此使毛囊器官再生的方法(例如，参考专利文献1)；利用对来源于躯体的多种细胞添加了Wnt信号活性剂的培养液来进行混合培养，由此形成原始的毛囊器官的方法(例如，参考专利文献2)；制作在毛囊间充质细胞的细胞集块(球体)的外侧粘结有上皮细胞的人工毛球体的方法(例如，参考专利文献3)等。以往技术文献专利文献专利文献1：国际公开第2012/108069号专利文献2：日本特开2013-78344号公报专利文献3：日本特开2003-70466号公报
技术实现思路
专利技术要解决的技术课题专利文献1～3中，制作上皮细胞及间充质细胞这2种细胞集合体并使它们融合，由此一个一个制作毛囊原基，再生数万根毛发时，制作效率及移植效率上存在问题。本专利技术是鉴于上述情况而完成的，其提供一种简便地制造与哺乳动物的毛囊组织类似、规则且高密度的再生毛囊原基的集合体的方法。用于解决技术课题的手段本专利技术包含以下方式。[1]一种再生毛囊原基的集合体的制造方法，其特征在于，具备如下工序，即，在由规则配置的微小凹部构成的微凹板播种间充质细胞及上皮细胞，并在供给氧的同时进行混合培养，由此形成毛囊原基。[2]根据[1]所述的再生毛囊原基的集合体的制造方法，其中，所述微凹板由具有透氧性的材质构成。[3]一种含毛囊组织薄片，其特征在于，含有包含间充质细胞及上皮细胞的毛囊原基及生物适应性水凝胶，所述毛囊原基规则地且以与哺乳动物的毛孔的密度相同的密度配置于所述生物适应性水凝胶上。[4]根据[3]所述的含毛囊组织薄片，其中，所述毛囊原基还进行分化而形成毛囊。[5]根据[3]或[4]所述的含毛囊组织薄片，其中，所述生物适应性水凝胶为凝胶化的细胞外基质成分。[6]根据[5]所述的含毛囊组织薄片，其中，所述细胞外基质成分为胶原蛋白。[7]根据[3]至[6]中任一项所述的含毛囊组织薄片，其中，所述毛囊原基的密度为20个/cm2以上且500个/cm2以下。[8]一种含毛囊组织薄片的制造方法，其特征在于，具备：在由规则配置的微小凹部构成的微凹板播种间充质细胞及上皮细胞，并进行混合培养，由此形成毛囊原基的工序；及将形成于所述微小凹部内的毛囊原基转印于生物适应性水凝胶的工序。[9]根据[8]所述的含毛囊组织薄片的制造方法，其中，所述微凹板中的所述微小凹部的密度为20个/cm2以上且500个/cm2以下。专利技术效果根据本专利技术，能够简便地获得规则且高密度的再生毛囊原基的集合体。附图说明图1是表示本实施方式中的含毛囊组织薄片的制造方法的一例的概略图。图2A是表示实施例1中的微凹板的制作方法的概略图。图2B是表示实施例1中的微凹板的整体、底面、底面的剖面的图像。图3是表示用实施例1中的微凹板形成的毛囊原基向胶原蛋白凝胶的转印方法的概略图及表示用实施例1中的相位差显微镜拍摄工序[a]～[c]中的胶原蛋白凝胶的结果的图像。图4是表示移植了试验例1中的含小鼠毛囊组织薄片的裸鼠的再生毛发的情况的图像。图5A是表示利用相位差荧光显微镜，以明视场观察实施例2中的从开始培养起第1天的混合球体的结果的图像。图5B是表示利用相位差荧光显微镜，以暗视场观察实施例2中的从开始培养起第1天及第3天的混合球体的结果的图像。图5C中，“Microscope”是表示用DAPI(4’，6-diamidino-2-phenylindole)染色液，对实施例2中的从开始培养起第3天的混合球体中的核进行染色，利用相位差荧光显微镜以暗视场进行观察的结果的图像。“ALP”是表示对实施例2中的从开始培养起第3天的混合球体进行碱性磷酸酶(alkalinephosphatase；ALP)染色，利用相位差荧光显微镜以明视场进行观察的结果的图像。“SEM”是表示用4％低聚甲醛固定液将实施例2中的从开始培养起第3天的混合球体固定化，并且使其冷冻干燥之后，用扫描电子显微镜(ScanningElectronMicroscope；SEM)进行观察的结果的图像。图6A是表示将实施例2中的从培养开始起第3天的混合球体移植到裸鼠(ICRnu/nu小鼠、5周龄)的皮下，从移植起第14天的裸鼠的情况的图像。图6B是表示将实施例2中的从培养开始起第3天的混合球体移植到裸鼠(ICRnu/nu小鼠、5周龄)的皮下，从移植起第21天的裸鼠的情况的图像。图7A是表示将实施例2中的从培养开始起第3天的混合球体移植到裸鼠(ICRnu/nu小鼠、5周龄)的皮下，从移植起第18天的裸鼠的移植部周围的毛发的再生根数与所移植的混合球体的细胞数的关系的曲线图。图7B是表示将实施例2中的从培养开始起第3天的混合球体移植到裸鼠(ICRnu/nu小鼠、5周龄)的皮下，从移植起第18天的裸鼠的毛囊组织的再生效率与所移植的混合球体的细胞数的关系的曲线图。图8是表示将实施例2中的从培养开始起第3天的混合球体移植到裸鼠(ICRnu/nu小鼠、5周龄)的皮下，从移植起第18天、第30天、第42天、第57天的裸鼠的移植部的情况的图像。图9是表示将试验例2中的从培养开始起第3天的混合球体移植到裸鼠(ICRnu/nu小鼠、5周龄)的皮下，制作从移植起第18天的裸鼠的移植部的组织切片并进行HE染色，对其利用相位差荧光显微镜以明视场进行观察的结果的图像，表示将试验例2中的从培养开始起第3天的混合球体移植到裸鼠(ICRnu/nu小鼠、5周龄)的皮下，制作从移植起第18天的裸鼠的移植部的组织切片，用小鼠Versican抗体进行免疫染色，并且对其利用相位差荧光显微镜以暗视场进行观察的结果的图像，及表示将试验例2中的从培养开始起第3天的混合球体移植到裸鼠(ICRnu/nu小鼠、5周龄)的皮下，制作从移植起第18天的裸鼠的移植部的组织切片，用小鼠CD34抗体进行免疫染色，并且对其利用相位差荧光显微镜以暗视场进行观察的结果的图像。图10是表示以明视场及暗视场观察试验例3中的从培养开始起第3天的用Oxy本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种再生毛囊原基的集合体的制造方法，其特征在于，具备如下工序，即，在由规则配置的微小凹部构成的微凹板播种间充质细胞及上皮细胞，并在供给氧的同时进行混合培养，由此形成毛囊原基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.30 JP 2015-2145471.一种再生毛囊原基的集合体的制造方法，其特征在于，具备如下工序，即，在由规则配置的微小凹部构成的微凹板播种间充质细胞及上皮细胞，并在供给氧的同时进行混合培养，由此形成毛囊原基。2.根据权利要求1所述的再生毛囊原基的集合体的制造方法，其中，所述微凹板由具有透氧性的材质构成。3.一种含毛囊组织薄片，其特征在于，含有包含间充质细胞及上皮细胞的毛囊原基及生物适应性水凝胶，所述毛囊原基规则地且以与哺乳动物的毛孔的密度相同的密度配置于所述生物适应性水凝胶上。4.根据权利要求3所述的含毛囊组织薄片，其中，所述毛囊原基还进行分化而形成毛囊。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：福田淳二，景山达斗，吉村知纱，大西希咲，
申请(专利权)人：国立大学法人横滨国立大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP