一种环己酮单加氧酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种环己酮单加氧酶及其应用，特别是公开了一种通过定点突变获得的环己酮单加氧酶及其应用，与SEQ ID NO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第386位丝氨酸Ser突变成天冬酰胺Asn，第435位丝氨酸Ser突变成苏氨酸Thr。实验表明，本发明专利技术的环己酮单加氧酶能够将高浓度的奥美拉唑硫醚底物催化转化为埃索美拉唑。

Cyclohexanone monooxygenase and its application

The present invention discloses a cyclohexanone monooxygenase and its application, in particular an open cyclohexanone monooxygenase obtained through a fixed-point mutation and its application. Compared with SEQ ID NO:1, the amino acid sequence of the cyclohexanone monooxygenase occurs at least one site at the following site mutation: 386th serine Ser mutations all day In winter amide Asn, 435th serine Ser is suddenly transformed into threonine Thr. The experiment shows that cyclohexanone monooxygenase of the invention can catalyze the conversion of omeprazole sulfide to esomeprazole.

【技术实现步骤摘要】
一种环己酮单加氧酶及其应用
本专利技术属酶工程
，涉及一种通过基因定点突变获得的环己酮单加氧酶及其应用，特别涉及所述环己酮单加氧酶在将高浓度的奥美拉唑硫醚底物催化转化为埃索美拉唑中的应用。
技术介绍
埃索美拉唑和奥美拉唑都是用于治疗胃溃疡的质子泵抑制剂(Protonpumpinhibitors，PPIs)，其中埃索美拉唑是S构型的奥美拉唑，其化学名称为5-甲氧基-2-((S)-((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基)亚硫酰基)-1H-苯并咪唑，CAS登录号为119141-88-7，化学结构如下式I所示。奥美拉唑的化学名称为5-甲氧基-2-(((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基)亚硫酰基)-1H-苯并咪唑，CAS登录号为73590-58-6，其化学结构如下式II所示。与奥美拉唑相比，埃索美拉唑具有肝脏首过效应低、血药浓度高、血浆半衰期长、生物利用度高、药物间相互作用小、药效强而持久等优势，尤其适合用于特殊人群，如老年人、肾功能不全和轻中度肝功能不全患者。此外，埃索美拉唑还适用于已经治愈的食管炎患者防止复发的长期维持治疗，与适当的抗菌疗法联合用药可根除幽门螺杆菌，并且能愈合与幽门螺杆菌感染相关的十二指肠溃疡，防止与幽门螺杆菌相关的消化性溃疡复发。埃索美拉唑以其卓著的品质名列2004年全球畅销药物第5位，销售额高达43亿美元。目前，已报道的埃索美拉唑的化学合成方法主要有拆分法和氧化法。专利CN103288801A公开了一种高纯度埃索美拉唑钠的制备方法，其通过向奥美拉唑钠溶液中加入三乙胺和L-(+)-扁桃的酸溶液实现拆分目的，然而该方法收率比较低，生产成本比较大，不适合工业化生产。专利CN102807560B公开了一种不对称氧化合成埃索美拉唑的方法，以手性配体(S,S)-6,6’-二羟基-2,2’-联苯二甲酸二乙酯与四异丙氧基钼形成的络合物为催化剂，以异丙基过氧化氢为氧化剂，对奥美拉唑硫醚物进行不对称催化氧化得到埃索美拉唑。但是由于该方法采用的催化剂比较复杂，市场很难获得，氧化剂异丙基过氧化氢比较昂贵，因此不适合规模化生产应用。埃索美拉唑的生物酶合成法具有反应收率高，产物手性选择性好，且无需重金属手性配体的优势。US5840552A通过筛选获得一系列可用于生物氧化反应的菌株，制备埃索美拉唑，其催化手性选择性较好，产物ee值大于99％，但是缺点是产物浓度较低，为ppm级别。CN102884178A公开了一种非天然存在的单加氧酶，用于催化合成拉唑类化合物，然而其一批反应可催化的底物浓度比较低(33g/L)，不利于工业化大规模应用。
技术实现思路
为了克服现有的生物酶合成法中反应底物奥美拉唑硫醚浓度过低的缺陷，本专利技术利用酶基因工程技术来对现有技术的环己酮单加氧酶进行改造和筛选，构建高酶活性的环己酮单加氧酶，从而可将高浓度的奥美拉唑硫醚底物催化转化为埃索美拉唑。因此，本专利技术的第一个目的是提供一种可将高浓度的奥美拉唑硫醚底物催化转化为埃索美拉唑的环己酮单加氧酶。与SEQIDNO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第386位丝氨酸(Ser，S)突变成天冬酰胺(Asn，N)，第435位丝氨酸(Ser，S)突变成苏氨酸(Thr，T)。其中SEQIDNO:1是现有的NCBI登录号为578026767的环己酮单加氧酶的氨基酸序列。在本专利技术的一个实施方案中，与SEQIDNO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第111位苏氨酸(T)突变成丝氨酸(S)，第386位丝氨酸(S)突变成天冬酰胺(N)。在本专利技术的一个实施方案中，与SEQIDNO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第288位异亮氨酸(Ile，I)突变成亮氨酸(Leu，L)，第435位丝氨酸(S)突变成苏氨酸(T)。在本专利技术的一个实施方案中，与SEQIDNO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第435位丝氨酸(S)突变成苏氨酸(T)，第516位缬氨酸(Val，V)突变成亮氨酸(L)。在本专利技术的一个实施方案中，与SEQIDNO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第386位丝氨酸(S)突变成天冬酰胺(N)，第435位丝氨酸(S)突变成苏氨酸(T)，第526位缬氨酸(Val，V)突变成亮氨酸(Leu，L)，。在本专利技术的一个实施方案中，与SEQIDNO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第111位苏氨酸(T)突变成丝氨酸(S)，第288位异亮氨酸(I)突变成亮氨酸(L)，第386位丝氨酸(S)突变成天冬酰胺(N)，第435位丝氨酸(S)突变成苏氨酸(T)，第516位缬氨酸(V)突变成亮氨酸(L)，第526位缬氨酸(V)突变成亮氨酸(L)，第537位苏氨酸(T)突变成丝氨酸(S)，第540位谷氨酰胺(Q)突变成天冬酰胺(N)。在本专利技术的一个实施方案中，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列选自：SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17；编码所述氨基酸的核苷酸序列相应分别选自：SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18。在本专利技术的一个实施方案中，提供编码上述环己酮单加氧酶突变体的基因。优选地，编码所述环己酮单加氧酶的基因的核苷酸序列选自：编码SEQIDNO:3的SEQIDNO:4；编码SEQIDNO:5的SEQIDNO:6；编码SEQIDNO:7的SEQIDNO:8；编码SEQIDNO:9的SEQIDNO:10；编码SEQIDNO:11的SEQIDNO:12；编码SEQIDNO:13的SEQIDNO:14；编码SEQIDNO:15的SEQIDNO:16；编码SEQIDNO:17的SEQIDNO:18。本专利技术通过采用QuickChangeSite-directedMutagenesis(Stratagene)方法(AgilentTechnologies)，对现有的NCBI登录号为578026767的环己酮单加氧酶基因片段进行蛋白质工程改造。在本专利技术的一个实施方案中，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)，对现有的NCBI登录号为578026767的环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是，对该环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQIDNO:1的第386位进行定点突变改造：F4：GATGCGGGCGATGGCAACTACAAGCGCATCGR4：CGATGCGCTTGTAGTTGCCATCGCCCGCATC。获得本专利技术的环己酮单加氧酶基因，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，对应的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。在本专利技术的一个实施方案中，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)，对现有的NCBI登录号为578026767的环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是，对该环己酮单加氧酶基因的氨基酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将奥美拉唑硫醚催化转化成埃索美拉唑的环己酮单加氧酶，其特征在于，与SEQ ID NO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第386位丝氨酸Ser突变成天冬酰胺Asn，第435位丝氨酸Ser突变成苏氨酸Thr。

【技术特征摘要】
1.一种将奥美拉唑硫醚催化转化成埃索美拉唑的环己酮单加氧酶，其特征在于，与SEQIDNO:1相比，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第386位丝氨酸Ser突变成天冬酰胺Asn，第435位丝氨酸Ser突变成苏氨酸Thr。2.根据权利要求1所述的环己酮单加氧酶，其特征在于，所述氨基酸序列选自：SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17。3.根据权利要求2所述的环己酮单加氧酶，其特征在于，编码所述氨基酸序列的环己酮单加氧酶基因的核苷酸序列分别相应选自：SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18。4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求1～3任一项所述的环己酮单加氧酶的表达基因。5.一种基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株携带权利要求1～3任一项所述的环己酮单加氧酶的表达基因。6.根据权利要求5所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株...

【专利技术属性】
技术研发人员：金志平，金圣芳，郑飞，张敏洁，黄悦，
申请(专利权)人：浙江京新药业股份有限公司，上海京新生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33