基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料及制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于氧化透明质酸‑II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料及制备方法，由氧化透明质酸、II型胶原蛋白和自体浓缩骨髓有核细胞制成，材料中的自体浓缩骨髓有核细胞具有自我更新及成软骨分化潜能，参与软骨缺损修复，因此具有很好的软骨损伤修复效果，修复组织呈透明软骨样，修复组织表面平整度、与邻近正常软骨的整合程度、II型胶原蛋白含量、GAG含量、钙化软骨层及软骨下骨形态等方面均明显优于空白对照组，有临床转化的潜能。

Articular cartilage repair material based on oxidized hyaluronic acid type -II collagen and autologous bone marrow nucleated cells and preparation method thereof

The invention relates to a articular cartilage repair material based on oxidized hyaluronic acid II collagen and autologous bone marrow nucleated cells. It is made from oxidized hyaluronic acid, II type collagen and autologous bone marrow nucleated cells. The autogenous bone marrow nucleated cells in the material have self renewal and chondrogenic differentiation. Potential and participation of cartilage defect repair, so it has a good repair effect of cartilage damage, repair tissue is transparent cartilage, repair tissue surface evenness, the degree of integration with adjacent normal cartilage, II type collagen content, GAG content, calcified cartilage layer and subchondral bone morphology are obviously superior to the blank control group It has the potential of clinical transformation.

【技术实现步骤摘要】
基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料及制备方法
本专利技术属于医学材料领域，涉及基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料，还涉及该材料的制备方法和应用。
技术介绍
关节软骨是衬附在关节表面的薄层致密结缔组织，其表面光滑，质地坚固而富有弹性，是人体关节重要的负重组织。而正常的关节软骨由于无血管、神经及淋巴分布，损伤后难以自行修复，至今仍然缺乏有效的修复策略。而临床工作中，关节软骨损伤的发生率较高，Widuchowski回顾性分析25,124例膝关节镜手术病例，发现60％病例存在软骨损伤。软骨损伤已成为导致关节疼痛、功能障碍甚至肢体残疾的重要原因。现阶段临床常用的损伤软骨修复策略主要包括：关节腔清理、微骨折、软骨移植、软骨细胞移植、骨软骨移植等，但以上修复策略长期疗效欠佳，治疗效果难以令人满意。软骨组织工程技术是关节软骨损伤修复较为理想的方法，但现阶段组织工程技术用于软骨修复仍存在诸多问题，如：程序较复杂；修复组织力学属性较差、与宿主组织整合欠佳以及纤维软骨退变等。因此，探索更为简便且具有更优修复效果的软骨组织工程策略具有重要意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料；本专利技术的目的之二在于提供基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料的制备方法；本专利技术的目的之三在于提供基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料的应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1.基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料，由氧化透明质酸、II型胶原蛋白和自体浓缩骨髓有核细胞制成。优选的，氧化透明质酸、II型胶原蛋白和自体浓缩骨髓有核细胞的加入量按每5×106个自体浓缩骨髓有核细胞加入100mgII型胶原蛋白混合均匀，通过漩涡震荡及离心，去除混合凝胶内气泡，将10ul氧化透明质酸溶液加入复合细胞的II型胶原蛋白、凝胶中。优选的，所述100mg/ml的氧化透明质酸由每100mg氧化透明质酸加入1mlPBS溶液，经完全溶解制得。更优选的，所述II型胶原蛋白由以下方法制备：将冻干软骨粉按质量体积比为20:1(g：L)用浓度为4M盐酸胍溶液搅拌混悬，搅拌后置于4℃条件下，消化软骨粉基质中的粘多糖至匀浆状态；消化完全后，将消化产物在4℃、8000rpm条件下离心20min，弃上清液，收集沉淀物，加水溶解，然后加入相当于盐酸胍溶液体积3/50倍的醋酸，加入相当于冻干软骨粉重量0.1倍的胃蛋白酶，加水至终体积为盐酸胍溶液的2倍，调节pH值于2.5-3之间，然后在4℃条件下消化48h；消化完毕后于立式高速离心机中8000rpm离心20min，弃沉淀，收集上清液；接着向上清液中缓慢倒入浓度为1.5M的NaOH溶液并搅拌至pH值为7.5时停止倒注，加入NaCl使其终浓度为3M，4℃条件下，8000rpm离心20min，收集沉淀物；沉淀物分装至透析袋中待透析液电导率，接近纯水电导率时结束透析；将透析袋内粘稠胶状溶液在4℃条件下，立式高速离心机8000rpm离心20min，收集沉淀物至无菌容量瓶中，加入0.15mol/L的盐酸溶液，溶解3天后白色沉淀蛋白分散、溶解呈凝胶状，搅拌均匀，分装，冻干，备用。更优选的，所述氧化透明质酸由以下方法制备：配制成质量分数为2％的透明质酸溶液，然后加入0.1g/ml的高碘酸钠溶液，搅拌，避光条件下完全氧化反应6小时，然后加入乙二醇终止反应，再将反应液灌入透析袋中至电导率接近纯水时结束透析，获得氧化透明质酸。更优选的，自体浓缩骨髓有核细胞由以下方法制备：对目前动物进行麻醉，然后用已经使用1000U/ml肝素预湿的注射器抽取骨髓血，然后将抽取的抗凝骨髓液加入等体积的无菌PBS液，混匀，混匀后将骨髓液沿管壁缓慢注入到含等体积的浓度为1.073g/ml的Percoll胞分离液中，注入过程保持分离液与混合液体之间界面的完整，接着采用Percoll密度梯度离心法获取自体浓缩骨髓有核细胞，先以2000rpm的速度离心混合液体15min，吸取有核细胞层，加入PBS溶液洗涤吸取的有核细胞，以1500rpm的速度离心洗涤细胞5min，弃上清。再次加入PBS吹打洗涤细胞，1000rpm速度离心5min，弃上清，加入PBS重悬即得。2、所述基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料的制备方法，具体步骤如下：将自体浓缩骨髓有核细胞先与II型胶原蛋白混合，然后再加入氧化透明质酸进行交联。3、所述基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料在制备关节软骨修复材料中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料，该材料由氧化透明质酸、II型胶原蛋白和自体浓缩骨髓有核细胞制成，植入的自体浓缩骨髓有核细胞具有自我更新及成软骨分化潜能，参与软骨缺损修复，因此制得的材料对软骨损伤具有很好的修复效果，修复组织呈透明软骨样，修复组织表面平整度、与邻近正常软骨的整合程度、II型胶原蛋白含量、GAG含量、钙化软骨层及软骨下骨形态等方面均明显优于空白对照组，有临床转化的潜能。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为SDS-PAGE电泳图(Lane1，Lane2和Lane3分别表示不同的上样量)。图2为II型胶原蛋白水凝胶摇菌实验。图3为骨髓间充质干细胞图(A：培养2天贴壁间充质干细胞；B：传代P3的间充质干细胞)。图4为II型胶原与间充质干细胞充分混合图(A：II型胶原与细胞共培养诱导；B：凝胶与间充质干细胞共培养)。图5为HA和OHA傅立叶红外光谱。图6为CCK-8检测结果。图7为OHA-COLII-BMSC在模具中成胶结果。图8为猪骨髓间充质干细胞三系诱导结果(A：间充质干细胞成骨诱导；B：间充质干细胞成脂诱导；C：间充质干细胞软骨诱导)。图9为OHA-COLII-BMSC成凝胶及培养不同时间切片结果(A：OHA-COLII-BMSC成凝胶结果；B：培养14小时后切片结果；C：培养21小时后切片结果；D：培养前凝胶切片结果；E：培养14小时凝胶切片结果；F：培养21天凝胶切片结果)。图10为软骨修复组织评分结果(A：MOCART评分结果；B：O`Driscoll评分结果；C：ICRS评分结果)。图11为氧化透明质酸的制备及与II型胶原蛋白产生交联反应原理图。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例1、氧化透明质酸II型胶原仿生凝胶的制备(1)软骨Ⅱ型胶原蛋白水凝胶的提取及鉴定a.制备软骨粉：获取新鲜贵州小香猪膝关节透明软骨，于-20℃冰箱冷冻12h，将冷冻软骨集于玻璃皿中，置于真空冷冻干燥机中，24h后冻干(温度降至-66℃，压强降至1Pa)，冷冻干燥后软骨片，倒入液氮低温粉碎机，持续充入液氮，软骨片粉碎成干燥软骨粉末，收集软骨粉至密封袋保存待用；b.Ⅱ型胶原蛋白的提取：称取20g冻干软骨粉置于烧杯中，倒入1L4M盐酸胍溶液搅拌混悬，磁力搅拌器持本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于氧化透明质酸‑II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料，其特征在于，由氧化透明质酸、II型胶原蛋白和自体浓缩骨髓有核细胞制成。

【技术特征摘要】
1.基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料，其特征在于，由氧化透明质酸、II型胶原蛋白和自体浓缩骨髓有核细胞制成。2.根据权利要求1所述基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料，其特征在于：氧化透明质酸、II型胶原蛋白和自体浓缩骨髓有核细胞的加入量按每2×106个自体浓缩骨髓有核细胞加入100mgII型胶原蛋白凝胶和10μl浓度为100mg/ml的氧化透明质酸溶液。3.根据权利要求1基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料，其特征在于：所述100mg/ml的氧化透明质酸由每100mg氧化透明质酸加入1mlPBS溶液，经完全溶解制得。4.根据权利要求1～3任一项所述基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料，其特征在于：所述II型胶原蛋白由以下方法制备：将冻干软骨粉按质量体积比为20:1(g：L)用浓度为4M盐酸胍溶液搅拌混悬，搅拌后置于4℃条件下，消化软骨粉基质中的粘多糖至匀浆状态；消化完全后，将消化产物在4℃、8000rpm条件下离心20min，弃上清液，收集沉淀物，加水溶解，然后加入相当于盐酸胍溶液体积3/50倍的醋酸，加入相当于冻干软骨粉重量0.1倍的胃蛋白酶，加水至终体积为盐酸胍溶液的2倍，调节pH值于2.5-3之间，然后在4℃条件下消化48h；消化完毕后于立式高速离心机中8000rpm离心20min，弃沉淀，收集上清液；接着向上清液中缓慢倒入浓度为1.5M的NaOH溶液并搅拌至pH值为7.5时停止倒注，加入NaCl使其终浓度为3M，4℃条件下，8000rpm离心20min，收集沉淀物；沉淀物分装至透析袋中待透析液电导率，接近纯水电导率时结束透析；将透析袋内粘稠胶状溶液在4℃条件下，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘俊利，曾伟南，曾一平，谭祖键，周明全，贾小林，张胜利，郝玉徽，
申请(专利权)人：重庆市人民医院，
类型：发明
国别省市：重庆,50