【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药，特别是涉及一种用于骨质疏松外泌体mirnas检测的电化学发光生物传感器及其制备与应用。
技术介绍
1、骨质疏松症是一种骨质量改变和骨量减低的系统性骨病，可导致骨脆性增强甚至骨折。在第一次骨折发生之前，临床上通常无症状。因此，早期诊断对于降低骨质疏松症患者的骨折率非常重要。目前，骨质疏松的常规诊断方法有超声检查法、骨密度检查法、x射线检测法、血清学检测法等，但这些方法多灵敏度低、特异性差，不利于骨质疏松症的早期诊断。多项研究表明，骨质疏松症相关的外泌体mirnas(exosomal mirnas，exomirnas)是骨质疏松症早期诊断很有前景的生物标志物。目前为止，qrt-pcr、rna印迹法、微阵列等常用于exomirnas的检测。然而，由于exomirnas的低丰度、高同源性和低表达性等不足，使其临床检测面临巨大挑战。
2、近年来，电化学发光(ecl)技术因其良好的可控性、高灵敏度、操作简单等优势，在生物标志物分析、食品检测、环境监测等各个领域受到越来越多的关注。目前，经典的ecl发光体主要包括鲁米诺、三联吡啶钌([ru(bpy)3]2+)及其衍生物，这些发光物质具有高电化学稳定性、低激发电位等性能，应用广泛。shen和他的同事们开发了一种基于tcpp-fe@hmuio@au-abei纳米发光体的超灵敏ecl生物传感器用于exomirna-155的检测。然而，过氧化氢在鲁米诺及其衍生物/h2o2体系中的不稳定性不可避免地会影响到水相中ecl的发光效率。此外，[ru(bpy)3]2+发光体由于其
技术实现思路
1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种用于骨质疏松外泌体mirnas检测的电化学发光生物传感器及其制备与应用，所述电化学发光生物传感器基于3ddna步行器和dna四面体(tdn)功能化的au nps@g-c3n4纳米材料构建而成，利用高效的作为信号转换和放大的3d dna步行器和优越的自发光au nps@g-c3n4纳米材料，实现目标exomirnas的超灵敏检测，为开发骨质疏松外泌体mirnas的超灵敏检测系统展示了一个可靠且很有前景的策略，并为骨质疏松症的早期临床诊断提供了一个很有前途的工具。
2、为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术第一方面提供一种用于骨质疏松外泌体mirnas检测的电化学发光生物传感器，包括三维磁性步行纳米机器(3d dna步行器)、aunps@g-c3n4纳米材料和dna四面体(tdn)、叶酸修饰的s4单链dna(s4-fa)和工作电极，
3、所述三维磁性步行纳米机器包括链霉亲和素标记的磁珠(smb)，与所述磁珠相结合并作为步行链的生物素修饰的s1/pp双链dna，与所述磁珠相结合并作为dna轨道的s2单链dna，以及作为驱动力的限制性核酸内切酶；所述s1/pp双链dna由生物素修饰的s1单链dna和保护探针pp杂交形成；
4、所述保护探针pp用于通过立足点置换与目标外泌体mirna杂交形成双链，释放出s1单链dna；所述s1单链dna能与所述s2单链dna杂交形成酶切位点；所述限制性核酸内切酶用于特异性识别所述酶切位点并切割出短链s3，同时释放s1单链dna；
5、所述au nps@g-c3n4纳米材料用于沉积在所述工作电极上，以获得电化学发光(ecl)响应信号并提供活性位点；所述dna四面体能通过au-s键与所述au nps@g-c3n4纳米材料结合并固定在所述工作电极上，作为支架，构建“自下而上”的锚定生物探针；所述叶酸修饰的s4单链dna用于与所述修饰电极上的dna四面体杂交以淬灭电化学发光响应信号；所述短链s3用于取代所述叶酸修饰的s4单链dna以恢复被猝灭的电化学发光响应信号。
6、进一步，所述dna四面体为四条单链dna组装形成dna四面体纳米结构，所述四条单链dna的核苷酸序列分别如seq id no.1～4所示；
7、所述s1单链dna、s2单链dna、保护探针pp、s3单链dna和s4单链dna的核苷酸序列依次如seq id no.5～9所示。
8、进一步，所述限制性核酸内切酶特异性识别的酶切位点为
9、进一步，所述限制性核酸内切酶选自nb.bbvci剪切酶。
10、进一步，所述骨质疏松外泌体mirnas选自exomirna-214，其核苷酸序列如seq idno.10所示。
11、进一步，所述s1/pp双链dna、s2单链dna的摩尔用量比为2～5:5～10，优选为3:7。
12、进一步，所述s1/pp双链dna由生物素修饰的s1单链dna和保护探针pp在37℃杂交反应形成；更进一步地，所述杂交反应时间不低于20min，优选为20～100min，更优选为60min。
13、进一步，所述链霉亲和素标记的磁珠(smb)与所述生物素修饰的s1/pp双链dna、所述s2单链dna结合形成修饰磁珠(s1/pp-s2-smb)，所述s1/pp双链dna和所述s2单链dna与所述磁珠结合的方法包括如下步骤：将所述s1/pp双链dna和所述s2单链dna加入到磁珠溶液中，在37℃搅拌反应；搅拌反应结束后，经磁性分离，清洗获得修饰磁珠；更进一步地，所述搅拌反应时间不低于20min，优选为20～100min，更优选为60min。
14、进一步，所述修饰磁珠、所述目标外泌体mirna与所述限制性核酸内切酶在37℃下进行反应；进一步地，所述限制性核酸内切酶的用量为50～500u ml-1，优选为100～300uml-1，更优选为200u ml-1，反应时间不低于20min，优选为20～100min，更优选为60min。
15、进一步，所述au nps@g-c3n4纳米材料为固定在g-c3n4纳米材料上的金纳米粒子aunps，所述au nps@g-c3n4纳米材料的制备方法包括如下步骤：将g-c3n4纳米材料溶解在金纳米粒子au nps溶液中，在室温下搅拌反应获得au nps@g-c3n4纳米材料；更进一步地，所述搅拌反应时间不低于12h，优选为12～48h，更优选为24h。
16、进一步，所述金纳米粒子au nps的合成方法包括如下步骤：以四氯金酸为金源，在还原剂作用下加热反应得到金纳米粒子au nps；优选地，所述还原剂选自柠檬酸钠。
17、进一步，在组装所述dna四面体时，所述四条单链dna的摩尔浓度相本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于骨质疏松外泌体miRNAs检测的电化学发光生物传感器，其特征在于，包括三维磁性步行纳米机器、Au NPs@g-C3N4纳米材料和DNA四面体、叶酸修饰的S4单链DNA和工作电极，
2.根据权利要求1所述的电化学发光生物传感器，其特征在于：所述DNA四面体为四条单链DNA组装形成DNA四面体纳米结构，所述四条单链DNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～4所示；
3.根据权利要求1所述的电化学发光生物传感器，其特征在于：所述限制性核酸内切酶特异性识别的酶切位点为
4.根据权利要求1所述的电化学发光生物传感器，其特征在于：所述限制性核酸内切酶选自Nb.BbvCI剪切酶。
5.根据权利要求1所述的电化学发光生物传感器，其特征在于：所述骨质疏松外泌体miRNAs选自exomiRNA-214，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
6.根据权利要求1～5任一项所述的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述修饰磁珠、所述目标外泌
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：用步骤Ⅰ收集到的短链S3取代所述叶酸修饰的S4单链DNA的取代反应时间不低于20min。
9.根据权利要求1～5任一项所述的电化学发光生物传感器和/或根据权利要求6～9任一项所述的方法制备得到的电化学发光生物传感器在制备骨质疏松外泌体miRNAs检测试剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：通过检测所述电化学发光响应信号测量目标外泌体miRNA的浓度，所述电化学发光响应信号强度与目标外泌体miRNA浓度呈正相关关系。
...【技术特征摘要】
1.一种用于骨质疏松外泌体mirnas检测的电化学发光生物传感器，其特征在于，包括三维磁性步行纳米机器、au nps@g-c3n4纳米材料和dna四面体、叶酸修饰的s4单链dna和工作电极，
2.根据权利要求1所述的电化学发光生物传感器，其特征在于：所述dna四面体为四条单链dna组装形成dna四面体纳米结构，所述四条单链dna的核苷酸序列分别如seq id no.1～4所示；
3.根据权利要求1所述的电化学发光生物传感器，其特征在于：所述限制性核酸内切酶特异性识别的酶切位点为
4.根据权利要求1所述的电化学发光生物传感器，其特征在于：所述限制性核酸内切酶选自nb.bbvci剪切酶。
5.根据权利要求1所述的电化学发光生物传感器，其特征在于：所述骨质疏松外泌体mirnas选自exomirna-214，其核苷酸序列如seq id no....
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