一种ERCC2基因的rs13181位点SNP核酸质谱检测方法技术

本发明专利技术提供了一种ERCC2基因rs13181位点SNP核酸质谱检测方法，首先通过第一步PCR反应扩增出含有SNP位点的片段，而非单独扩增SNP位点，以提高样品的可操作性以及后续操作的精度；通过SAP对步骤S1得到的扩增产物进行去磷酸化处理，防止DNA分子5'端与3'端连接，在后续步骤准备好之前让DNA分子保持线性状态，从而保证后续实验的准确度；最后通过步骤S3对rs13181位点进行单碱基延伸，利用变性‑退火内循环使DNA双链充分解螺旋、分离，从而实现不同SNP的精确分型。通过上述方法，可以快速、准确地获得ERCC2基因rs13181位点的SNP分型信息，操作简便、可靠性强，可以为后续的相关研究提供可靠的参考信息。

【技术实现步骤摘要】
一种ERCC2基因的rs13181位点SNP核酸质谱检测方法
本专利技术属于SNP检测
，特别涉及一种ERCC2基因的rs13181位点SNP核酸质谱检测方法。
技术介绍
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。ERCC2基因又称DNA切除修复基因，位于19号染色体13.2～13.3处，是核苷酸切除修复通路中的重要基因。ERCC2基因具有多种功能，一方面参与核苷酸切除修复途径，并且可以在使用铂类药物化疗过程中取出铂-DNA加合物；另一方面其编码的蛋白还参与组成Ⅱ转录因子复合物及p53介导的凋亡反应，同时还参与基础转录。ERCC2基因上存在中多SNP位点，每个SNP位点的不同表达形式均可能对上述病症产生不同的影响。其中rs13181位点的野生型为TT，同时还存在GT和GG两种形式的突变型。目前已有研究表明，这两种突变型均会增加皮肤黑色素瘤的患病风险，同时GG型还可能与卵巢癌的发生存在相关性。因此，提供一种高效、准确的SNP检测方法，将会为研究ERCC2对上述疾病的影响机制提供重要的参考信息和理论支持。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种ERCC2基因的rs13181位点SNP核酸质谱检测方法。本专利技术具体技术方案如下：本专利技术一方面提供了一种ERCC2基因的rs13181位点SNP核酸质谱检测引物组，包括如下引物：上游引物rs13181-F：5`-ACGTTGGATGTAAGACCTTCTAGCACCACC-3`(如SEQ.ID.No.1所示)；下游引物rs13181-R：5`-ACGTTGGATGAGCAGCTAGAATCAGAGGAG-3`(如SEQ.ID.No.2所示)；延伸引物rs13181-E：5`-CAATCTGCTCTATCCTCT-3`(如SEQ.ID.No.3所示)；ERCC2基因的rs13181位点野生型碱基序列如SEQ.ID.No.4所示。本专利技术另一方面提供了一种应用该引物组的ERCC2基因rs13181位点SNP核酸质谱检测方法，包括如下步骤：S1：用上游引物rs13181-F和下游引物rs13181-R进行第一轮PCR，对模板DNA进行扩增，得到含有所述rs13181位点的片段；S2：对步骤S1得到的片段进行去磷酸化处理，得到脱磷酸片段；S3：用延伸引物rs13181-E对所述脱磷酸片段进行单碱基延伸，对不同SNP进行分型；S4：对步骤S3得到的样品进行脱盐处理，用质谱仪进行检测。进一步地，步骤S1中，第一轮PCR的反应体系中包括如下组分：模板DNA2ng/μl、rs13181-F引物0.05μM、rs13181-R引物0.05μM、Mg2+4mM、1×PCRBuffer、dNTP10μM以及TaqDNA聚合酶1U。进一步地，步骤S1中，第一轮PCR的反应条件如下：(1)预变性：95℃2min；(2)扩增：95℃30s，56℃30s，72℃60s，共45个循环；(3)延伸：72℃5min，4℃∞。步骤S1的目的是扩增出含有SNP位点的片段，而非单独扩增SNP位点，以提高样品的可操作性以及后续操作的精度；“4℃∞”即为保持在4℃下，以防止外界温度剧烈变化对扩增产物造成影响。进一步地，步骤S2中，去磷酸化的反应体系在第一轮PCR扩增产物的基础上还包括如下成分：0.24×SAPBuffer以及SAP酶0.5U。进一步地，步骤S2中，去磷酸化的反应条件如下：(1)去磷酸化：37℃40min；(2)SAP酶灭活：85℃5min，4℃∞。步骤S2的目的是通过SAP对步骤S1得到的扩增产物进行去磷酸化处理，防止DNA分子5'端与3'端连接，在后续步骤准备好之前让DNA分子保持线性状态，从而保证后续实验的准确度。进一步地，步骤S3中，单碱基延伸的反应体系在去磷酸化产物的基础上还包括如下成分：0.222×iPLEXGOLDBuffer、1×iPLEXTerminationmix、iPLEX延伸引物0.15μM以及1×iPLEXEnzyme。进一步地，步骤S3中，单碱基延伸的反应条件如下：(1)预变性：94℃30s；(2)扩增内循环：94℃5s，52℃5s，共5个循环；(3)扩增外循环：94℃5s，52℃5s，80℃5s，共40个循环；(4)延伸：72℃4min，4℃∞。步骤S3的目的是对rs13181位点的序列进行单碱基延伸，从而实现不同SNP的分型。本方案中，在变性-退火-延伸的外循环中间还对变性-退火设置内循环，以便充分将DNA的双链解旋、分离，从而提高DNA单链的分离程度以及单碱基延伸的准确性。进一步地，所述步骤S4包括如下步骤：S4.1：在树脂板上铺好洁净树脂待用，每孔6mg树脂，风干10～20分钟；S4.2：向样本板的样本空内加入待测样品，每个样本孔再加15～20μLddH2O，用封口膜密封，进行瞬时离心；S4.3：打开覆盖所述样本孔的封口膜，将所述样本板倒扣在所述树脂板上固定，将固定好的样本板和树脂板整体翻转，轻敲树脂板，以使树脂板中的树脂完全落入样本板上相应样本孔，用封口膜密封，进行瞬时离心；S4.4：将样本树脂混合物摇匀，在旋转器上慢速旋转15min后，在4000rpm条件下离心5min，离心后点样上机、用质谱仪对样品进行检测。步骤S4的目的是去除样品中溶解的盐类，防止盐类对质谱系统造成污染、影响信号的生成，从而保证测量结果的可靠性。本专利技术的有益效果如下：本专利技术提供了一种ERCC2基因rs13181位点SNP核酸质谱检测方法，首先通过第一步PCR反应扩增出含有SNP位点的片段，而非单独扩增SNP位点，以提高样品的可操作性以及后续操作的精度；通过SAP对步骤S1得到的扩增产物进行去磷酸化处理，防止DNA分子5'端与3'端连接，在后续步骤准备好之前让DNA分子保持线性状态，从而保证后续实验的准确度；最后通过步骤S3对rs13181位点进行单碱基延伸，利用变性-退火内循环使DNA双链充分解螺旋、分离，从而实现不同SNP的精确分型。通过上述方法，可以快速、准确地获得ERCC2基因rs13181位点的SNP分型信息，操作简便、可靠性强，可以为后续的相关研究提供可靠的参考信息。附图说明图1为实验例1中不同方法的rs13181位点SNP分型结果比较；图2为实验例2中所有样品的rs13181位点SNP分型示意图；图3为实验例2中样品rs13181位点的TT纯合型的质谱图；图4为实验例2中样品rs13181位点的GT杂合型的质谱图；图5为实验例2中样品rs13181位点的GG纯合型的质谱图。具体实施方式实施例一种ERCC2基因的rs13181位点SNP核酸质谱检测方法，包括如下步骤：S1：用上游引物rs13181-F和下游引物rs13181-R进行第一轮PCR，对模板DNA进行扩增，引物的碱基序列如下：上游引物rs13181-F：5`-ACGTTGGATGTAAGACCTTCTAGCACCACC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ERCC2基因rs13181位点SNP核酸质谱检测引物组，其特征在于，包括如下引物：上游引物rs13181‑F：5`‑ACGTTGGATGTAAGACCTTCTAGCACCACC‑3`；下游引物rs13181‑R：5`‑ACGTTGGATGAGCAGCTAGAATCAGAGGAG‑3`；延伸引物rs13181‑E：5`‑CAATCTGCTCTATCCTCT‑3`。

【技术特征摘要】
1.一种ERCC2基因rs13181位点SNP核酸质谱检测引物组，其特征在于，包括如下引物：上游引物rs13181-F：5`-ACGTTGGATGTAAGACCTTCTAGCACCACC-3`；下游引物rs13181-R：5`-ACGTTGGATGAGCAGCTAGAATCAGAGGAG-3`；延伸引物rs13181-E：5`-CAATCTGCTCTATCCTCT-3`。2.一种应用权利要求1所述引物组的ERCC2基因rs13181位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：用上游引物rs13181-F和下游引物rs13181-R进行第一轮PCR，对模板DNA进行扩增，得到含有所述rs13181位点的片段；S2：对步骤S1得到的片段进行去磷酸化处理，得到脱磷酸片段；S3：用延伸引物rs13181-E对所述脱磷酸片段进行单碱基延伸，对SNP碱基序列进行扩增，从而实现不同SNP的分型；S4：对步骤S3得到的样品进行脱盐处理，用质谱仪进行检测。3.如权利要求2所述的ERCC2基因rs13181位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，步骤S1中，第一轮PCR的反应体系中包括如下组分：模板DNA2ng/μl、rs13181-F引物0.05μM、rs13181-R引物0.05μM、Mg2+4mM、1×PCRBuffer、dNTP10μM以及TaqDNA聚合酶1U。4.如权利要求3所述的ERCC2基因rs13181位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，步骤S1中，第一轮PCR的反应条件如下：(1)预变性：95℃2min；(2)扩增：95℃30s，56℃30s，72℃60s，共45个循环；(3)延伸：72℃5min，4℃∞。5.如权利要求2所述的ERCC2基因rs13181位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，步骤S2中，去磷酸化的反应体系...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂宵，林茂俊，张鹏，刘晓霞，白杨杨，
申请(专利权)人：沃森克里克北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11