检测MSI的非诊断方法技术

本发明专利技术公开检测MSI的非诊断方法。从血液分离血浆和白细胞，并提取血浆中的ctDNA，和白细胞中的gDNA；分别以ctDNA和gDNA为模板建立测序文库和标准文库并测序；在测序文库和标准文库中分别确定各位点中重复单元的序列，并分别统计各序列长度，计算各序列长度的相对频率分布，去除序列长度等于300bp及测序文库与标准文库共有的序列长度的相对频率，以各位点在测序文库和标准文库中的相对频率绘制分布曲线，根据两条曲线是否趋势一致判断是否存在MSI。本发明专利技术的方法能够有效检测血液中肿瘤细胞的微卫星不稳定状态，而不依赖于肿瘤组织，从而减轻患者取样时的痛苦，检测方便快捷。

【技术实现步骤摘要】
检测MSI的非诊断方法
本专利技术通常涉及基因检测领域，特别地涉及微卫星重复序列长度改变的检测方法。
技术介绍
微卫星(MS)为广泛分布于原核及有核细胞生物且由1-6个核苷酸组成的，具有高度多态性的简单串联重复序列。尽管MS在个体之间存在高度的多态性，但在个体内部保持一定的遗传稳定性(孟德尔共显性遗传)，因此，MS是重要的一类遗传标记，可以用于遗传性疾病的连锁分析和基因诊断。位于编码区的MS易于出现复制滑脱(比一般编码区中其他基因的发生概率高10～100倍)，当突变、缺失或者表观沉默导致错配修复(MMR)基因失去功能，从而不能修复DNA复制过程中滑动链与互补碱基出现的错配，导致一个或几个重复的碱基插入或缺失，进而产生MSI表型。目前临床主要采用多重荧光PCR结合毛细管电泳进行MSI检测，通过扩增正常组织和肿瘤组织DNA，将等位基因谱进行比较分析，如果肿瘤样本DNA的等位基因出现异常的分型，表明存在微卫星不稳定，但是该技术存在的问题如下：(1)检测时要求必须同时制备肿瘤组织或正常组织(如，癌旁组织)，虽然检测结果准确，但是肿瘤组织需要手术或者活检取材，给患者创伤较大，如果部分患者因身体或其它原因无法进行手术或穿刺，这就造成患者无法完成检测。(2)肿瘤具有异质性，如果取材不当，可能导致检测假阴性。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种检测MSI的非诊断方法，可以不依赖于肿瘤组织，只抽取患者血液即可完成检测。具体地，本专利技术包括以下内容。一种检测MSI的非诊断方法，其包括以下步骤：(1)样品制备步骤：从血液分离血浆和白细胞，并提取血浆中的ctDNA作为待检测样品，和白细胞中的gDNA作为标准样品，其中ctDNA经过agilent2100生物分析仪检测，确保其中gDNA含量低于ctDNA的1/3。(2)文库构建步骤：以所述ctDNA为模板建立测序文库，同时以所述gDNA为模板建立标准文库，其中各文库建立时用于PCR扩增的引物组由SEQIDNO:1-14组成；(3)文库测序步骤：以相同的方法分别对测序文库和标准文库进行测序；(4)测序结果的分析步骤，其中包括在测序文库和标准文库中分别确定各位点中重复单元的序列，并分别统计各序列长度，计算各序列长度的相对频率分布，去除序列长度等于300bp及测序文库与标准文库共有的序列长度的相对频率，以各位点在测序文库和标准文库中的相对频率绘制分布曲线，并根据两条曲线是否趋势一致判断是否存在MSI。根据本专利技术的方法，优选地，在样品制备步骤中，使用基于生物芯片的技术进行片段分析来确保gDNA的含量低于所述ctDNA的1/3。根据本专利技术的方法，优选地，所述引物组包括位点引物和性别引物。根据本专利技术的方法，优选地，文库构建包括使用SEQIDNO:1-14组成的引物组进行多重PCR扩增，纯化扩增产物，并将纯化产物使用非PCR(PCR-Free)方式(包括末端修复、加A和接头连接)进行文库构建。根据本专利技术的方法，优选地，文库构建包括在引物上添加文库接头。优选地，在各位点的正向引物的5’端添加SEQIDNO:15所示的序列，并在各位点的反向引物5’端添加SEQIDNO:16所示的序列。优选地，进一步包括以ctDNA或gDNA为模板，使用添加文库接头的引物进行杂交和目标区域连接，生成杂交链；然后以此杂交链为模板进行PCR扩增。优选地此处PCR扩增时所使用的引物为SEQIDNO:17和SEQIDNO:18所示的序列。根据本专利技术的方法，优选地，在文库测序步骤中使用高通量测序技术分别对测序文库和标准文库进行测序。根据本专利技术的方法，优选地，在测序结果的分析步骤中，如果各位点在测序文库和标准文库的序列长度的相对频率分布曲线一致，则计数为0，否则计数为1。优选地，统计各位点的总分数值x，即，x＝位点1的计数+位点2的计数+位点3的计数……+位点n的计数。当x＝0时，为稳定型，当x＝1时为低频不稳定型，当x>1时为高频不稳定型。本专利技术的方法能够有效富集血液中含量极低的ctDNA，并有效排除背景噪音的影响，可以有效检测血液中肿瘤细胞的卫星不稳定状态，而不依赖于肿瘤组织，从而减轻患者取样时的痛苦，检测方便、快捷。附图说明图1.BAT-25基因Marker的长度相对频率分布；图2.BAT-26基因Marker的长度相对频率分布；图3.MONO-27基因Marker的长度相对频率分布；图4.NR-21基因Marker的长度相对频率分布；图5.NR-24基因Marker的长度相对频率分布；图6.NR-27基因Marker的长度相对频率分布。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。关于本文中所使用的“和/或”，包括所述事物的任一或全部组合。本专利技术的MSI是指微卫星不稳定，其以DNA微卫星重复序列长度改变为特征，是基因组不稳定的一种类型，可导致多种肿瘤，例如结直肠癌。本专利技术的一方面，针对现有MSI检测方法存在的问题，特别是针对目前取样时需要手术或者活检取材，给患者带来畏惧和伤害的问题，通过使用容易获取的血液代替传统的肿瘤组织作为样品可以很好的实现MSI的检测。本专利技术的另一方面，通过整体优化检测的各具体步骤，并通过这些步骤的组合能够以高灵敏度和准确性来检测血液中极低含量样品中的细微碱基变化，并基于这些碱基变化来准确地进行MSI表型的判断。具体地，本专利技术的MSI检测方法包括样品制备步骤、文库构建步骤、文库测序步骤和测序结果的分析步骤。下面详细说明各步骤。样品制备步骤：本专利技术首次使用容易获取的血液作为检测MSI的样品。已知ctDNA是肿瘤患者血液中游离的来自肿瘤的DNA，其带有肿瘤的特征。通过ctDNA的检测可以检测肿瘤相关的某些特异性突变的信息，进而了解肿瘤的特征，但是并非所有的肿瘤相关的特异性突变均体现于ctDNA中。这是因为肿瘤细胞死亡破裂时基因组DNA会受到破坏，在释放的过程中存在片段化，所以血液中的ctDNA并非完全真实的反应肿瘤基因组的信息。目前我们未发现现有技术中来自血液的ctDNA包含了MSI信息的文献记载。本专利技术的样品制备首先需要从血液中分离血浆，并从血浆中提取ctDNA作为待检测样品。可使用本领域已知的任何手段进行提取，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测MSI的非诊断方法，其包括以下步骤：(1)样品制备步骤：从血液分离血浆和白细胞，并提取血浆中的ctDNA作为待检测样品，和白细胞中的gDNA作为标准样品；其中所述gDNA的含量低于所述ctDNA的1/3；(2)文库构建步骤：以所述ctDNA为模板建立测序文库，同时以所述gDNA为模板建立标准文库，其中各文库建立时用于PCR扩增的引物组由SEQ ID NO:1‑14组成；(3)文库测序步骤：以相同的方法分别对所述测序文库和所述标准文库进行测序；(4)测序结果的分析步骤，其中包括在所述测序文库和所述标准文库中分别确定各位点中重复单元的序列，并分别统计各序列长度，计算各序列长度的相对频率分布，去除序列长度等于300bp及所述测序文库与所述标准文库共有的序列长度的相对频率，以各位点在所述测序文库和所述标准文库中的相对频率绘制分布曲线，并根据两条曲线是否趋势一致判断是否存在MSI。

【技术特征摘要】
1.一种检测MSI的非诊断方法，其包括以下步骤：(1)样品制备步骤：从血液分离血浆和白细胞，并提取血浆中的ctDNA作为待检测样品，和白细胞中的gDNA作为标准样品；其中所述gDNA的含量低于所述ctDNA的1/3；(2)文库构建步骤：以所述ctDNA为模板建立测序文库，同时以所述gDNA为模板建立标准文库，其中各文库建立时用于PCR扩增的引物组由SEQIDNO:1-14组成；(3)文库测序步骤：以相同的方法分别对所述测序文库和所述标准文库进行测序；(4)测序结果的分析步骤，其中包括在所述测序文库和所述标准文库中分别确定各位点中重复单元的序列，并分别统计各序列长度，计算各序列长度的相对频率分布，去除序列长度等于300bp及所述测序文库与所述标准文库共有的序列长度的相对频率，以各位点在所述测序文库和所述标准文库中的相对频率绘制分布曲线，并根据两条曲线是否趋势一致判断是否存在MSI。2.根据权利要求1所述的非诊断性方法，其中在所述样品制备步骤中，使用生物芯片进行片段分析来确保ctDNA中gDNA的含量低于所述ctDNA的1/3。3.根据权利要求1所述的非诊断性方法，其中所述引物组包括位点引物和性别引物。4.根据权利要求1所述的非诊断性方法，其中所述文库构建步骤包括使用SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：臧国梁，郎继东，梁羽，
申请(专利权)人：元码基因科技北京股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11