猪瘟抗体胶体金检测卡及其制备方法技术

本发明专利技术属于示踪免疫化学物品技术领域，具体涉及一种猪瘟抗体胶体金快速定量检测卡；所述猪瘟病毒抗体胶体金检测卡包括第一载体、第二载体和底板，所述第一载体和第二载体均设置在底板上，所述第一载体上包被有0.4‑1.2mg/ml的猪瘟重组E2抗原和0.5‑1.5mg/ml的羊抗鼠免疫球蛋白G。本发明专利技术的猪瘟抗体胶体金检测卡检测方法简单，操作简便；可得到具体的阻断率；特异性强；性质稳定，重现性好；有效期长。

【技术实现步骤摘要】
猪瘟抗体胶体金检测卡及其制备方法
本专利技术属于示踪免疫化学物品
，具体涉及一种猪瘟抗体胶体金检测卡及其制备方法。
技术介绍
猪瘟又称为烂肠瘟、经典猪瘟，是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、发热、具有高度传染性的疫病，在自然条件下只感染猪，不同年龄、性别、品种的猪和野猪均易感，一年四季均可发生，且致死率高达80％-90％，传播迅速，蔓延地区广，对养猪业构成了极大威胁。猪瘟于1833年首次发现于美国，之后流行遍及全球，给养猪业造成了巨大的经济损失。猪瘟是妨碍养猪业发展的主要疫病之一，近年来，我国因各种疾病死亡的牲猪占饲养总数的8％-10％，其中1/3以上是猪瘟致死，每年造成数十亿元的经济损失。我国于1954年首次成功研制出猪瘟兔化弱毒疫苗，在防治猪瘟工作中起到了重要作用，取得了显著性效果。通过接种疫苗有效控制了猪瘟的发生，而疫苗免疫效果的优劣对猪瘟防控起着决定性作用。因此，在猪瘟的防疫中，猪瘟抗体水平的检测是十分必要的，其反应了猪对猪瘟病毒的抵抗能力及疫苗免疫效果；同时，猪瘟抗体水平的检测也是疫苗免疫效果评价的主要方法。目前，猪瘟抗体水平检测方法主要有以下两种：第一种是用血凝实验，但血凝实验凭主观经验判断结果，主观性较强，误差较大，且操作复杂，检测效率低，不适合大批量检测；第二种是用ELISA试剂盒检测猪瘟抗体水平，市场上的ELISA试剂盒虽可批量检测，但需要专业人员操作且整个检测过程时间长，需要近3个小时，较快的间接ELISA方法也需要1.5小时，且ELISA试剂盒需要4℃保存，使用时要先恢复至室温，操作不方便，此外，ELISA试剂盒多以进口为主，价格昂贵。也有用猪瘟抗体胶体金检测卡来检测猪瘟抗体水平的，但其只能做定性检测，即根据T线的有无判定样本中猪瘟抗体的阴阳性，这种判定方法凭肉眼观察，主观性较强，误差较大。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于猪瘟病毒抗体胶体金检测卡，该检测卡在常温下即可保存，能够对猪瘟抗体水平进行定量检测，且避免了人为主观判断造成的差异。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：猪瘟病毒抗体胶体金检测卡，包括第一载体、第二载体和底板，所述第一载体和第二载体均设置在底板上，所述第一载体上包被有0.4-1.2mg/ml的猪瘟重组E2抗原和0.5-1.5mg/ml的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)。进一步，所述第二载体上喷有胶体金标记的猪瘟重组E2抗原和小鼠免疫球蛋白G，胶体金标记的猪瘟重组E2抗原和小鼠免疫球蛋白G是猪瘟重组E2抗原和小鼠免疫球蛋白G与胶体金颗粒溶液通过静电吸附结合而成。进一步，所述第二载体上猪瘟重组E2抗原按照浓度为0.005-0.015mg/ml进行标记，小鼠免疫球蛋白G按照浓度0.005-0.015mg/ml进行标记。进一步，所述胶体金颗粒溶液中的胶体金颗粒大小为38-42nm。进一步，所述第一载体为硝酸纤维素膜，第二载体为经过预处理的胶体金结合垫。进一步，所述预处理具体为将胶体金结合垫置于胶体金结合垫处理液中使其全部浸湿，于40-50℃温度下烘干3-5h。所述胶体金结合垫处理液的配置方法为：取干酪素2.5g和蔗糖20g，然后加0.02mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液定容至1L。所述磷酸盐缓冲溶液的配置方法为：分别配置0.02M磷酸二氢钠水溶液(一水磷酸二氢钠2.16g，溶于蒸馏水中，定容至1000mL)和0.02M磷酸氢二钠水溶液(十二水合磷酸氢二钠7.16g，溶于蒸馏水中，定容至1000mL)。取190mL0.02M磷酸二氢钠水溶液和810mL0.02M磷酸氢二钠水溶液混合均匀。进一步，所述猪瘟重组E2抗原和羊抗鼠免疫球蛋白G按照1.0μL/cm的划膜量包被到硝酸纤维素膜上。进一步，所述猪瘟重组E2抗原和小鼠免疫球蛋白G标记的胶体金溶液按照10μL/cm的喷金量喷到胶体金结合垫上。进一步，所述底板为PVC底板。进一步，所述胶体金结合垫为聚酯垫。本专利技术的目的还在于保护所述检测卡的制备方法，包括以下步骤：A.胶体金溶液的制备：取超纯水煮沸，加入四水合氯金酸溶液，再加入柠檬酸三钠溶液，至溶液颜色由黑色逐渐变为酒红色，继续煮沸10-20min后停止加热，冷却；B.将猪瘟重组E2抗原和羊抗鼠免疫球蛋白G包被到第一载体上并干燥；将胶体金溶液调节pH值至7.8-8.2，用猪瘟重组E2抗原和小鼠免疫球蛋白G标记，离心去上清液后，悬浮沉淀，分别得到猪瘟重组E2抗原和小鼠免疫球蛋白G标记的胶体金溶液，然后混匀；混合液包被在第二载体上并干燥；C.组装检测卡：将包被有猪瘟重组E2抗原和羊抗鼠免疫球蛋白G的第一载体及喷有猪瘟重组E2抗原和小鼠免疫球蛋白G标记的胶体金的第二载体组装在底板上。所述超纯水又称UP水，是指电阻率在25℃时达到18MΩ*cm的水。进一步，所述干燥时间为37-52℃，时间为1-3h。本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术的猪瘟抗体胶体金检测卡检测方法简单，操作简便，检测只需5-10分钟，可用于单个样本的检测，适合疫病的快速检测。(2)本专利技术的猪瘟抗体胶体金检测卡特异性强，与猪圆环病毒病阳性血清、猪伪狂犬病阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征阳性血清、猪乙型脑炎阳性血清和猪蓝耳病阳性血清的疫病抗体无交叉反应。(3)本专利技术的猪瘟抗体胶体金检测卡的性质稳定，重现性好。(4)本专利技术的检测卡结合定量读数仪，给出T/C值及对应的阻断率，避免了人为主观判断造成的差异。(5)与ELISA结果相比，本专利技术的猪瘟抗体胶体金检测卡的灵敏度高达88.4％，特异性为92.9％，总符合率为90.1％；且检测猪瘟抗体阳性样本的阻断率与ELISA结果有较好的符合度，相对误差在15％以内。(6)本专利技术的检测卡在常温下即可保存，有效期至少为12个月；本专利技术的检测卡45℃条件下保存8周，结果差异小于15％；在常温25℃下保存16个月，检测结果差异小于15％。附图说明图1为实施例2的猪瘟抗体胶体金检测卡标准曲线图。具体实施方式所举实施例是为了更好地对本专利技术的内容进行说明，但并不是本专利技术的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
技术实现思路
对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。以下四水合氯金酸购自国药集团化学试剂有限公司；猪瘟重组E2抗原由北京龙科方舟生物工程技术有限公司提供；羊抗鼠IgG和小鼠IgG购自上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜购自美国Millipore公司；胶体金结合垫、样品垫和吸水纸购自上海金标生物科技有限公司；猪瘟病毒抗体检测试剂盒(ELISA)购自美国IDEXX有限公司；猪圆环病毒病阳性血清、猪伪狂犬病阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征阳性血清、猪乙型脑炎阳性血清、猪蓝耳病阳性血清和待检血清来自重庆市畜牧科学院；以下喷金操作是用的三维平面点膜喷金仪HM3030，购自上海金标生物科技有限公司；以下切条操作是用的微电脑自动斩切机ZQ2000，购自上海金标生物科技有限公司；离心操作是用的高速冷冻离心机H-2050R，购自长沙湘仪离心机仪器有限公司；扫描操作是用的紫外连续扫描分光光度计，购自美国Thermo公司；搅拌是用的数显磁力搅拌电热套，购自天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；胶体金定量读数仪购自深圳元秦科技有限公司；干燥操作是用的电热恒温鼓风干燥箱，购自本文档来自技高网...

【技术保护点】
猪瘟病毒抗体胶体金检测卡，包括第一载体、第二载体和底板，所述第一载体和第二载体均设置在底板上，其特征在于，所述第一载体上包被有0.4‑1.2mg/ml的猪瘟重组E2抗原和0.5‑1.5mg/ml的羊抗鼠免疫球蛋白G。

【技术特征摘要】
1.猪瘟病毒抗体胶体金检测卡，包括第一载体、第二载体和底板，所述第一载体和第二载体均设置在底板上，其特征在于，所述第一载体上包被有0.4-1.2mg/ml的猪瘟重组E2抗原和0.5-1.5mg/ml的羊抗鼠免疫球蛋白G。2.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述第二载体上喷有胶体金标记的猪瘟重组E2抗原和小鼠免疫球蛋白G，胶体金标记的猪瘟重组E2抗原和小鼠免疫球蛋白G是猪瘟重组E2抗原和小鼠免疫球蛋白G与胶体金颗粒溶液通过静电吸附结合而成。3.根据权利要求2所述的检测卡，其特征在于，所述第二载体上猪瘟重组E2抗原按照浓度为0.005-0.015mg/ml进行标记、小鼠免疫球蛋白G按照浓度为0.005-0.015mg/ml进行标记。4.根据权利要求2或3所述的检测卡，其特征在于，所述胶体金颗粒溶液中的胶体金颗粒大小为38-42nm。5.根据权利要求1、2、3或4所述的检测卡，其特征在于，所述第一载体为硝酸纤维素膜，第二载体为经过预处理的胶体金结合垫。6.根据权利要求5所述的检测卡，其特征在于，所述预处理具体为将胶体金结合垫置于胶体金结合垫处理液中使其全部浸湿，于40-50℃温度下烘干3-5h。7.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：李成洪，宋青龙，王晓中，唐达，黄升，傅巍，李时英，
申请(专利权)人：重庆市畜牧科学院，北京龙科方舟生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50