一种高精度检测微生物与净污载体固着强度的方法技术

本发明专利技术提出的是一种高精度检测微生物与净污载体固着强度的方法，具体包括以下步骤：（1）负载微生物的净污载体准备；（2）按取样时间设置N个试验组；（3）将负载微生物的净污载体进行流水冲刷，对水体和净污载体取样留存；（4）提取净污载体和水体微生物DNA，选择PCR扩增引物；（5）准备检测微生物丰度的标准曲线样品；（6）配置PCR反应体系，设置反应程序，进行实时荧光定量PCR；（7）计算水体及净污载体上微生物丰度、固着率及有效固着时间。优点：（1）检测精度高，误差小；（2）可以精确区分不同微生物类群；（3）实时快速检测；（4）技术手段成熟，简单方便。

【技术实现步骤摘要】
一种高精度检测微生物与净污载体固着强度的方法
本专利技术涉及的是一种高精度检测微生物与净污载体固着强度的方法，属于水环境修复

技术介绍
在水环境修复
，微生物修复因具有低能耗、无二次污染、高效性、操作简便、经济实用和应用范围广等优点目前在河湖污染治理、农田退水氮磷及农药去除等方面备受青睐，成为去除水环境中污染物的一种重要途径。在实际原位修复应用中，为发挥土著微生物或人工筛选获得的特异性功能菌的作用，通常借助自然过程、人为施用的物理或化学方法将微生物与净污载体进行耦合附着，将原本游离的微生物负载或者限定至净污载体特定的表面空间范围，以最大化保留微生物自身反应活性并发挥其功能。目前人们已利用吸附法、交联法、共价结合法等将微生物固着于多种净污载体（如活性炭、多孔生态砖、有机玻璃、多孔陶粒、天然高分子载体等）上，即微生物固定化。与游离微生物相比，固定化微生物具有微生物密度高、反应速度快、反应过程控制较容易等优点，已应用于生产实际且成果显著。而微生物与净污载体的固着结合强度是控制其修复效率的关键因素。固着方法、菌株特性、净污载体类型、水动力特征等都会对微生物与净污载体的固着强度产生影响。在实际应用前，根据待修复区域的水动力特征，明确微生物与净污载体的固着强度对保障修复效果的尤为重要。然而，由于目前微生物与净污载体固着强度检测的方法十分有限，且现有方法准确性差，大多数负载微生物的净污载体未经固着强度检测即盲目的投入原位应用，在某些水域造成微生物脱落严重、修复效果差、生物风险高等后果。在公开号为CN103940695A的中国专利文献中，公开了一种炭纤维载体的微生物固着强度的测试方法，该方法使用超声-震荡后称重差减法表征微生物与碳纤维载体的固着强度，尽管该方法对固着强度进行了定量检测，但超声-震荡并非实际水环境中真实存在条件，且称重差减法存在准确性低、时效性差、无法区分不同微生物类群等弊端，亟需研发一种检测精度高、误差小、可区分不同微生物类群、方便快捷的微生物与净污载体固着强度检测方法。这种检测方法对指导人们因地制宜地科学选择和优化实施微生物修复技术具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提出的是一种高精度检测微生物与净污载体固着强度的方法，其目的旨在克服现有微生物与净污载体固着强度检测方法的不足，提高准确性、时效性，区分不同微生物类群。本专利技术的技术解决方案：一种高精度检测微生物与净污载体固着强度的方法，具体包括以下步骤：（1）准备负载微生物的净污载体并取样留存待测；（2）按取样时间设置N个试验组（4<N<10），取待修复水体灭菌并根据待修复水体流速设置水槽内水体流速；（3）将负载微生物的净污载体放入水槽并经流水冲刷，冲刷不同时间，依次对N个试验组中水体和净污载体取样留存待测；（4）提取步骤（1）和（3）中留存的净污载体和水体微生物DNA，根据检测微生物的目标基因选择PCR扩增引物；（5）准备检测微生物丰度的标准曲线样品；（6）配置PCR反应体系，设置反应程序，将待测样品和制作标线样品同时进行实时荧光定量PCR；（7）根据标准曲线计算水体及净污载体上微生物丰度，通过分析流失到水体中的、残存在载体上的及原载体上的微生物丰度检验方法的准确性，计算固着率及有效固着时间。本专利技术的优点：1）以微生物的绝对丰度进行准确定量，检测精度高，误差小;2）利用特异性引物对特定基因片段进行PCR扩增，可区分不同微生物类群；3）检测时间短、效率高；4）检测过程技术手段成熟，有商品化试剂盒，简单快捷。附图说明附图1是实施例中检测细菌丰度的标准曲线示意图。附图2是实施例中流失到水体中细菌的丰度随冲刷时间变化的示意图。附图3是实施例中残留在净污载体上的细菌丰度随冲刷时间变化的的示意图。附图4是实施例中净污载体上细菌的固着率随冲刷时间变化的示意图。具体实施方式一种高精度检测微生物与净污载体固着强度的方法，具体包括以下步骤：（1）准备负载微生物的净污载体并取样留存待测；（2）按取样时间设置N个试验组，取待修复水体灭菌并根据待修复水体流速设置水槽内水体流速；（3）将负载微生物的净污载体放入水槽并经流水冲刷，冲刷不同时间，依次对N个试验组中水体和净污载体取样留存待测；（4）提取步骤（1）和（3）中留存的净污载体和水体微生物DNA，根据检测微生物的目标基因选择PCR扩增引物；（5）准备检测微生物丰度的标准曲线样品；（6）配置PCR反应体系，设置反应程序，将待测样品和制作标线样品同时进行实时荧光定量PCR；（7）根据标准曲线计算水体及净污载体上微生物丰度，通过分析流失到水体中的、残存在载体上的及原载体上的微生物丰度检验方法的准确性，计算固着率及有效固着时间。所述步骤（1）中的净污载体优选多孔载体材料，所负载微生物为人工筛选获得的功能微生物菌株、菌群或土著微生物，负载微生物的净污载体准备时优选将净污载体在自然水体中放置一段时间，使其表面形成由土著微生物形成的生物膜；如选择功能微生物菌株或菌群则优选共培养吸附法，尽量保证净污载体表面负载微生物的均匀性。所述步骤（2）中的按取样时间设置N个试验组：取待修复水体，对水体进行高温灭菌（120℃，20分钟），将灭菌后的水体加入N个水槽中，水槽中水体流速根据待修复水体流速进行统一设置，N个水槽即对应N个试验组（4<N<10）。所述步骤（3）中将净污载体放置于水槽后记录流水冲刷时间为t=0分钟，在不同冲刷时间（0<t<180分钟）分别对N个试验组中的水体和净污载体取样，水槽中水体后经0.22μm滤膜过滤用来收集水体中微生物，每个试验组的滤膜和净污载体样品放置于-20℃冰箱保存，用于步骤（4）中微生物DNA样品的提取。所述步骤（4）中留存的净污载体和水体中微生物DNA的提取分别用土壤DNA提取试剂盒和水体DNA提取试剂盒（推荐使用PowerSoil和PowerWaterDNAExtractionkit）；根据检测目标微生物的不同选择不同的扩增基因，选择相应的扩增引物。所述步骤（5）中检测微生物丰度标准曲线的样品准备：首先要对DNA模板浓度进行测定，然后对DNA模板进行10倍梯度稀释，至少形成6个梯度。所述步骤（6）PCR反应体系总体积优选为20μl，反应体系包括无菌水8.4μl，荧光定量试剂（推荐SYBRGreenRealtime）10μl，正向引物（20μM）0.6μl，反向引物（20μM）0.6μl，DNA样品0.4μl，其中DNA样品包括标曲样品、待测的水体及净污载体中DNA样品；PCR反应体系配好后放置在实时荧光定量PCR仪中，设置PCR反应程序，通常为94℃1分钟，40循环（变性94℃30秒，退火50-62℃30秒，延伸72℃30秒），退火具体温度根据检测目标基因进行选择。所述步骤（7）根据荧光定量PCR结果以标准曲线样品的Ct值为X坐标，标准曲线样品已知的微生物丰度为Y坐标绘制标准曲线；根据标准曲线，用水体及净污载体DNA样品检测得到的Ct值来计算待测样品中的微生物丰度；微生物丰度检测方法的准确性检验方法为计算某时刻水体中与残存在载体上微生物丰度之和，与原载体上微生物丰度进行比较，如两者偏差在±5%以内则说明检测方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高精度检测微生物与净污载体固着强度的方法，具体包括以下步骤：（1）负载微生物的净污载体准备；（2）按取样时间设置N个试验组；（3）将负载微生物的净污载体进行流水冲刷，对水体和净污载体取样留存；（4）提取净污载体和水体微生物DNA，选择PCR扩增引物；（5）准备检测微生物丰度的标准曲线样品；（6）配置PCR反应体系，设置反应程序，进行实时荧光定量PCR；（7）计算水体及净污载体上微生物丰度、固着率及有效固着时间。

【技术特征摘要】
1.一种高精度检测微生物与净污载体固着强度的方法，具体包括以下步骤：（1）负载微生物的净污载体准备；（2）按取样时间设置N个试验组；（3）将负载微生物的净污载体进行流水冲刷，对水体和净污载体取样留存；（4）提取净污载体和水体微生物DNA，选择PCR扩增引物；（5）准备检测微生物丰度的标准曲线样品；（6）配置PCR反应体系，设置反应程序，进行实时荧光定量PCR；（7）计算水体及净污载体上微生物丰度、固着率及有效固着时间。2.根据权利要求1所述的一种高精度检测微生物与净污载体固着强度的方法，其特征是所述步骤（1）中的净污载体优选多孔载体材料，所负载微生物为人工筛选获得的功能微生物菌株、菌群或土著微生物，负载微生物的净污载体准备时优选将净污载体在自然水体中放置一段时间，使其表面形成由土著微生物形成的生物膜；如选择功能微生物菌株或菌群则优选共培养吸附法，尽量保证净污载体表面负载微生物的均匀性。3.根据权利要求1所述的一种高精度检测微生物与净污载体固着强度的方法，其特征是所述步骤（2）中的按取样时间设置N个试验组：取待修复水体，对水体进行120℃高温灭菌20分钟，将灭菌后的水体加入N个水槽中，水槽中水体流速根据待修复水体流速进行统一设置，N个水槽即对应N个试验组，4<N<10。4.根据权利要求1所述的一种高精度检测微生物与净污载体固着强度的方法，其特征是所述步骤（3）中将净污载体放置于水槽后记录流水冲刷时间为t=0分钟，在不同冲刷时间即0<t<180分钟，分别对N个试验组中的水体和净污载体取样，水槽中水体后经0.22μm滤膜过滤用来收集水体中微生物，每个试验组的滤膜和净污载体样品放置于-20℃冰箱保存，用于步骤（4）中微生物DNA样品的提取。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：陈娟，王沛芳，王超，
申请(专利权)人：河海大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32