一种高灵敏度检测稀有突变的超阻滞荧光定量PCR方法技术

本发明专利技术公开了一种高灵敏度检测稀有突变的超阻滞荧光定量PCR方法。本发明专利技术采用了特异性引物和探针技术，可以实现血液样本基因点突变的快速检测。本发明专利技术的优势包括：(1)在常规ARMS引物的基础上增加了LNA修饰或者在3’末二位‑末三位额外引入错配碱基，既不影响突变检测灵敏度，又保证了突变特异性引物检测单碱基突变的特异性；(2)引入与野生型完全互补的修饰阻滞探针，兼顾突变型扩增效率的基础上进一步降低野生型背景干扰；(3)在引入高特异性修饰阻滞探针的基础上，ARMS引物可以同时检测同一个位点的不同碱基突变形式，从而实现同一个基因多个位点只用几个体系实现兼并检测；(4)灵敏度高；(5)检测速度快。

A highly sensitive method for detecting rare mutations by super block fluorescence quantitative PCR

The invention discloses a super sensitive fluorescence quantitative PCR method for detecting rare mutations with high sensitivity. The invention adopts specific primers and probe technology to realize rapid detection of gene mutation in blood samples. The advantages of the present invention include: (1) adding LNA modification on the basis of conventional ARMS primers or adding additional mismatch bases at the end of the 3 'end two bits, which does not affect the sensitivity of mutation detection, but also ensures the specificity of mutation specific primers to detect single base mutation; (2) introducing a modified block probe complementing the wild type. On the basis of the mutation type amplification efficiency, the wild type background interference is further reduced; (3) on the basis of the introduction of high specific modified block probes, ARMS primers can detect the different base mutation forms at the same site at the same time, so that the multiple loci of the same gene can be realized by using only a few systems to realize merger detection; (4) it is sensitive. High degree; (5) fast detection speed.

【技术实现步骤摘要】
一种高灵敏度检测稀有突变的超阻滞荧光定量PCR方法
本专利技术涉及临床诊断分子生物学领域，具体涉及一种高灵敏度检测稀有突变的超阻滞荧光定量PCR方法。
技术介绍
随着人们对肿瘤发生过程的不断深入，目前认为癌症发生和基因突变有关，导致肿瘤细胞失控性增殖，因此可以根据基因突变情况来进行肿瘤筛查，再进行肿瘤易感基因检测，如果发现明确的异常，可以起到有针对性的提示作用。化疗是目前临床上治疗恶性肿瘤的最重要手段之一，但是，随着其在临床上的广泛运用，耐药问题日益突出，肿瘤细胞常常会对化疗药物产生耐药而导致患者对治疗不再敏感，最终导致化疗失败甚至疾病复发，其中EGFR基因T790M突变占临床耐药NSCLC患者的60％以上，而K-ras基因状态与结直肠癌(CRC)治疗密切相关，携带野生型K-ras基因的mCRC患者从EGFR抑制剂的治疗中获益更大，而K-ras基因突变的mCRC患者无法从EGFR抑制剂联合化疗方案中获益。传统肿瘤检测样本获取，一般需要通过手术或穿刺原位，对病人产生创伤、无法进行动态监测等局限性，而新型“液体活检”从血浆为代表的体液样本获得游离核酸或细胞，进而应用于肿瘤早期诊断、靶向药物的选择以及动态疗效监测等，但由于肿瘤细胞或核酸在外周血中的含量相当低，因此血浆分子检测对检测技术的灵敏度要求较之组织更高。目前基因突变检测的方法很多，包括如DNA直接测序、焦磷酸测序(Pyrosequencing)、变性高效液相色谱法(HDPLC)、高分辨率溶解曲线技术(HRM)、限制小片段长度多态性分析法(RFLP)、ARMS-PCR等。其中DNA直接测序为突变检测的金标准，但该方法存在以下缺点：检测的敏感性不够高，如果突变基因的含量占基因组DNA总量的10％以下时，则用直接测序法检测不到突变样本的存在；且操作过程复杂，检测时间较长，对操作人员要求高；非闭管操作，涉及到PCR扩增后的操作，因此易被污染，假阴性率较高，造成结果的不理想；测序结果的判读主观性强；一次实验检测的样本量有限，最多只能8-24例。因此直接测序法难以在临床普遍开展。ARMS-PCR方法能够达到1％的灵敏度，对于肿瘤组织样本能够满足检测需求，但是对于取样方便的血液样本，如血浆或者血液中的循环肿瘤细胞，肿瘤DNA含量往往低于1％，ARMS-PCR方法不足以对血液进行检测，局限了临床医生对靶向药物疗效的判断。此外，在临床用药过程中产生的耐药性突变，以前的方法由于灵敏度不够也无法进行检测。因此，从这些低含量样本中检测突变的基因，需要找一种灵敏性高、特异性强、简便易行、结果判定简单的突变检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高灵敏度检测稀有突变的超阻滞荧光定量PCR方法。本专利技术提供了一种用于检测核酸中的特异位点的引物探针组合，为如下(a1)或(a2)：(a1)由通用上游引物、通用下游引物、通检探针、特异扩增上游引物和阻滞探针组成；所述通用上游引物为通用上游引物-Ⅰ或通用上游引物-Ⅱ；所述通用下游引物为通用下游引物-Ⅰ或通用下游引物-Ⅱ；所述通用上游引物-Ⅰ和所述通用下游引物-Ⅰ的组合用于扩增靶序列；所述靶序列为所述核酸中的片段且含有所述特异位点；所述通用上游引物-Ⅰ和所述通用下游引物-Ⅰ中不含有所述特异位点；所述通用上游引物-Ⅱ为将通用上游引物-Ⅰ经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与通用上游引物-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述通用下游引物-Ⅱ为将通用下游引物-Ⅰ经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与通用下游引物-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述通检探针为反向通检探针或正向通检探针；所述反向通检探针为反向通检探针-Ⅰ或反向通检探针-Ⅱ；所述反向通检探针-Ⅰ与所述靶序列中所述特异位点以外的某一区段反向互补；所述反向通检探针-Ⅱ为将反向通检探针-Ⅰ经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与反向通检探针-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述正向通检探针为正向通检探针-Ⅰ或正向通检探针-Ⅱ；所述正向通检探针-Ⅰ与所述靶序列中所述特异位点以外的某一区段相同；所述正向通检探针-Ⅱ为将正向通检探针-Ⅰ经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与正向通检探针-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述通检探针的两个末端分别采用荧光基团和淬灭基团修饰；所述特异扩增上游引物为特异扩增上游引物-Ⅰ或特异扩增上游引物-Ⅱ或特异扩增上游引物-Ⅲ；所述特异扩增上游引物-Ⅰ满足如下三个条件：与所述靶序列中的某一区段相同、3’末端核苷酸对应所述特异位点、3’末端核苷酸与突变后核苷酸相同；所述特异扩增上游引物-Ⅱ为将特异扩增引物-Ⅰ经过除所述特异位点以外的一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与特异扩增上游引物-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述特异扩增上游引物-Ⅲ为将特异扩增上游引物-Ⅰ或特异扩增上游引物-Ⅱ中的1-5个核苷酸进行LNA修饰得到的DNA分子；所述阻滞探针为阻滞探针-Ⅰ或阻滞探针-Ⅱ或阻滞探针-Ⅲ；所述阻滞探针-Ⅰ满足如下两个条件：与所述靶序列中的某一区段相同、某一个核苷酸对应所述特异位点且该核苷酸与突变前核苷酸相同；所述阻滞探针-Ⅱ为将阻滞探针-Ⅰ经过除所述特异位点以外的一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与阻滞探针-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述阻滞探针-Ⅲ为将阻滞探针-Ⅰ或阻滞探针-Ⅱ中的1-5个核苷酸进行LNA修饰得到的DNA分子；所述阻滞探针的3’末端进行阻断修饰；(a2)由通用上游引物、通用下游引物、通检探针、特异扩增下游引物和阻滞探针组成；所述通用上游引物和通用下游引物为(a1)中所述的通用上游引物；所述通检探针为(a1)中所述的通检探针；所述特异扩增下游引物为特异扩增下游引物-Ⅰ或特异扩增下游引物-Ⅱ或特异扩增下游引物-Ⅲ；所述特异扩增下游引物-Ⅰ满足如下三个条件：与所述靶序列中的某一区段反向互补、3’末端核苷酸对应所述特异位点、3’末端核苷酸与突变后核苷酸互补；所述特异扩增下游引物-Ⅱ为将特异扩增下游引物-Ⅰ经过除所述特异位点以外的一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与特异扩增下游引物-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述特异扩增上游引物-Ⅲ为将特异扩增下游引物-Ⅰ或特异扩增下游引物-Ⅱ中的1-5个核苷酸进行LNA修饰得到的DNA分子；所述阻滞探针为阻滞探针-Ⅳ或阻滞探针-Ⅴ或阻滞探针-Ⅵ；所述阻滞探针-Ⅳ满足如下两个条件：与所述靶序列中的某一区段反向互补、某一个核苷酸对应所述特异位点且该核苷酸与突变前核苷酸互补；所述阻滞探针-Ⅴ为将阻滞探针-Ⅳ经过除所述特异位点以外的一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与阻滞探针-Ⅳ具有相同功能的DNA分子；所述阻滞探针-Ⅵ为将阻滞探针-Ⅳ或阻滞探针-Ⅴ中的1-5个核苷酸进行LNA修饰得到的DNA分子；所述阻滞探针的3’末端进行阻断修饰；所述特异位点为核酸中发生目标点突变的位点；所述特异位点上，未发生目标点突变的核苷酸命名为突变前核苷酸，发生目标点突变的核苷酸命名为突变后核苷酸。所述阻断修饰具体可为氨基化、双脱氧或磷酸化修饰。所述通检探针可选择1-5个核苷酸进行LNA修饰。所述通检探针可采用MGB修饰。采用MGB修饰时，所述通检探针一端采用荧光基团修饰，另本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测核酸中的特异位点的引物探针组合，为如下(a1)或(a2)：(a1)由通用上游引物、通用下游引物、通检探针、特异扩增上游引物和阻滞探针组成；所述通用上游引物为通用上游引物‑Ⅰ或通用上游引物‑Ⅱ；所述通用下游引物为通用下游引物‑Ⅰ或通用下游引物‑Ⅱ；所述通用上游引物‑Ⅰ和所述通用下游引物‑Ⅰ的组合用于扩增靶序列；所述靶序列为所述核酸中的片段且含有所述特异位点；所述通用上游引物‑Ⅰ和所述通用下游引物‑Ⅰ中不含有所述特异位点；所述通用上游引物‑Ⅱ为将通用上游引物‑Ⅰ经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与通用上游引物‑Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述通用下游引物‑Ⅱ为将通用下游引物‑Ⅰ经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与通用下游引物‑Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述通检探针为反向通检探针或正向通检探针；所述反向通检探针为反向通检探针‑Ⅰ或反向通检探针‑Ⅱ；所述反向通检探针‑Ⅰ与所述靶序列中所述特异位点以外的某一区段反向互补；所述反向通检探针‑Ⅱ为将反向通检探针‑Ⅰ经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与反向通检探针‑Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述正向通检探针为正向通检探针‑Ⅰ或正向通检探针‑Ⅱ；所述正向通检探针‑Ⅰ与所述靶序列中所述特异位点以外的某一区段相同；所述正向通检探针‑Ⅱ为将正向通检探针‑Ⅰ经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与正向通检探针‑Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述通检探针的两个末端分别采用荧光基团和淬灭基团修饰；所述特异扩增上游引物为特异扩增上游引物‑Ⅰ或特异扩增上游引物‑Ⅱ或特异扩增上游引物‑Ⅲ；所述特异扩增上游引物‑Ⅰ满足如下三个条件：与所述靶序列中的某一区段相同、3’末端核苷酸对应所述特异位点、3’末端核苷酸与突变后核苷酸相同；所述特异扩增上游引物‑Ⅱ为将特异扩增引物‑Ⅰ经过除所述特异位点以外的一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与特异扩增上游引物‑Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述特异扩增上游引物‑Ⅲ为将特异扩增上游引物‑Ⅰ或特异扩增上游引物‑Ⅱ中的1‑5个核苷酸进行LNA修饰得到的DNA分子；所述阻滞探针为阻滞探针‑Ⅰ或阻滞探针‑Ⅱ或阻滞探针‑Ⅲ；所述阻滞探针‑Ⅰ满足如下两个条件：与所述靶序列中的某一区段相同、某一个核苷酸对应所述特异位点且该核苷酸与突变前核苷酸相同；所述阻滞探针‑Ⅱ为将阻滞探针‑Ⅰ经过除所述特异位点以外的一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与阻滞探针‑Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述阻滞探针‑Ⅲ为将阻滞探针‑Ⅰ或阻滞探针‑Ⅱ中的1‑5个核苷酸进行LNA修饰得到的DNA分子；所述阻滞探针的3’末端进行阻断修饰；(a2)由通用上游引物、通用下游引物、通检探针、特异扩增下游引物和阻滞探针组成；所述通用上游引物和通用下游引物为(a1)中所述的通用上游引物；所述通检探针为(a1)中所述的通检探针；所述特异扩增下游引物为特异扩增下游引物‑Ⅰ或特异扩增下游引物‑Ⅱ或特异扩增下游引物‑Ⅲ；所述特异扩增下游引物‑Ⅰ满足如下三个条件：与所述靶序列中的某一区段反向互补、3’末端核苷酸对应所述特异位点、3’末端核苷酸与突变后核苷酸互补；所述特异扩增下游引物‑Ⅱ为将特异扩增下游引物‑Ⅰ经过除所述特异位点以外的一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与特异扩增下游引物‑Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述特异扩增上游引物‑Ⅲ为将特异扩增下游引物‑Ⅰ或特异扩增下游引物‑Ⅱ中的1‑5个核苷酸进行LNA修饰得到的DNA分子；所述阻滞探针为阻滞探针‑Ⅳ或阻滞探针‑Ⅴ或阻滞探针‑Ⅵ；所述阻滞探针‑Ⅳ满足如下两个条件：与所述靶序列中的某一区段反向互补、某一个核苷酸对应所述特异位点且该核苷酸与突变前核苷酸互补；所述阻滞探针‑Ⅴ为将阻滞探针‑Ⅳ经过除所述特异位点以外的一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与阻滞探针‑Ⅳ具有相同功能的DNA分子；所述阻滞探针‑Ⅵ为将阻滞探针‑Ⅳ或阻滞探针‑Ⅴ中的1‑5个核苷酸进行LNA修饰得到的DNA分子；所述阻滞探针的3’末端进行阻断修饰；所述特异位点为核酸中发生目标点突变的位点；所述特异位点上，未发生目标点突变的核苷酸命名为突变前核苷酸，发生目标点突变的核苷酸命名为突变后核苷酸。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测核酸中的特异位点的引物探针组合，为如下(a1)或(a2)：(a1)由通用上游引物、通用下游引物、通检探针、特异扩增上游引物和阻滞探针组成；所述通用上游引物为通用上游引物-Ⅰ或通用上游引物-Ⅱ；所述通用下游引物为通用下游引物-Ⅰ或通用下游引物-Ⅱ；所述通用上游引物-Ⅰ和所述通用下游引物-Ⅰ的组合用于扩增靶序列；所述靶序列为所述核酸中的片段且含有所述特异位点；所述通用上游引物-Ⅰ和所述通用下游引物-Ⅰ中不含有所述特异位点；所述通用上游引物-Ⅱ为将通用上游引物-Ⅰ经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与通用上游引物-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述通用下游引物-Ⅱ为将通用下游引物-Ⅰ经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与通用下游引物-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述通检探针为反向通检探针或正向通检探针；所述反向通检探针为反向通检探针-Ⅰ或反向通检探针-Ⅱ；所述反向通检探针-Ⅰ与所述靶序列中所述特异位点以外的某一区段反向互补；所述反向通检探针-Ⅱ为将反向通检探针-Ⅰ经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与反向通检探针-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述正向通检探针为正向通检探针-Ⅰ或正向通检探针-Ⅱ；所述正向通检探针-Ⅰ与所述靶序列中所述特异位点以外的某一区段相同；所述正向通检探针-Ⅱ为将正向通检探针-Ⅰ经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与正向通检探针-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述通检探针的两个末端分别采用荧光基团和淬灭基团修饰；所述特异扩增上游引物为特异扩增上游引物-Ⅰ或特异扩增上游引物-Ⅱ或特异扩增上游引物-Ⅲ；所述特异扩增上游引物-Ⅰ满足如下三个条件：与所述靶序列中的某一区段相同、3’末端核苷酸对应所述特异位点、3’末端核苷酸与突变后核苷酸相同；所述特异扩增上游引物-Ⅱ为将特异扩增引物-Ⅰ经过除所述特异位点以外的一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与特异扩增上游引物-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述特异扩增上游引物-Ⅲ为将特异扩增上游引物-Ⅰ或特异扩增上游引物-Ⅱ中的1-5个核苷酸进行LNA修饰得到的DNA分子；所述阻滞探针为阻滞探针-Ⅰ或阻滞探针-Ⅱ或阻滞探针-Ⅲ；所述阻滞探针-Ⅰ满足如下两个条件：与所述靶序列中的某一区段相同、某一个核苷酸对应所述特异位点且该核苷酸与突变前核苷酸相同；所述阻滞探针-Ⅱ为将阻滞探针-Ⅰ经过除所述特异位点以外的一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与阻滞探针-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述阻滞探针-Ⅲ为将阻滞探针-Ⅰ或阻滞探针-Ⅱ中的1-5个核苷酸进行LNA修饰得到的DNA分子；所述阻滞探针的3’末端进行阻断修饰；(a2)由通用上游引物、通用下游引物、通检探针、特异扩增下游引物和阻滞探针组成；所述通用上游引物和通用下游引物为(a1)中所述的通用上游引物；所述通检探针为(a1)中所述的通检探针；所述特异扩增下游引物为特异扩增下游引物-Ⅰ或特异扩增下游引物-Ⅱ或特异扩增下游引物-Ⅲ；所述特异扩增下游引物-Ⅰ满足如下三个条件：与所述靶序列中的某一区段反向互补、3’末端核苷酸对应所述特异位点、3’末端核苷酸与突变后核苷酸互补；所述特异扩增下游引物-Ⅱ为将特异扩增下游引物-Ⅰ经过除所述特异位点以外的一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与特异扩增下游引物-Ⅰ具有相同功能的DNA分子；所述特异扩增上游引物-Ⅲ为将特异扩增下游引物-Ⅰ或特异扩增下游引物-Ⅱ中的1-5个核苷酸进行LNA修饰得到的DNA分子；所述阻滞探针为阻滞探针-Ⅳ或阻滞探针-Ⅴ或阻滞探针-Ⅵ；所述阻滞探针-Ⅳ满足如下两个条件：与所述靶序列中的某一区段反向互补、某一个核苷酸对应所述特异位点且该核苷酸与突变前核苷酸互补；所述阻滞探针-Ⅴ为将阻滞探针-Ⅳ经过除所述特异位点以外的一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与阻滞探针-Ⅳ具有相同功能的DNA分子；所述阻滞探针-Ⅵ为将阻滞探针-Ⅳ或阻滞探针-Ⅴ中的1-5个核苷酸进行LNA修饰得到的DNA分子；所述阻滞探针的3’末端进行阻断修饰；所述特异位点为核酸中发生目标点突变的位点；所述特异位点上，未发生目标点突变的核苷酸命名为突变前核苷酸，发生目标点突变的核苷酸命名为突变后核苷酸。2.如权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于：所述靶序列的大小为100-350bp。3.如权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于：所述通用上游引物和所述通用下游引物的大小为13-25nt；所述通检探针的大小为12-30nt；所述特异扩增上游引物或所述特异扩增下游引物的大小为12-25nt；所述阻滞探针的大小为12-30nt。4.如权利要求1至3任一所述引物探针组合，其特征在于：所述特异扩增上游引物自3’端第2-3位引入与靶序列不同的错配碱基；所述特异扩增下游引物自3’端第2-3位引入与靶序列不互补的错配碱基。5.如权利要求1至4任一所述引物探针组合，其特征在于：所述通检探针一端采用FAM荧光基团标记，另一端采用BHQ1淬灭基团标记；所述阻滞探针进行氨基修饰。6.一种检测核酸中的特异位点的方法，为方法A或方法B；所述方法A包括如下步骤：(a)以待测核酸为模板，采用权利要求1至4中任一所述的引物探针组合(a1)中的通用上游引物、通用下游引物、通检探针进行荧光定量PCR；(b)以待测核酸为模板，采用权利要求1至4中任一所述引物探针组合(a1)中的特异扩增上游引物、通用下游引物、通检探针和阻滞探针进行荧光定量PCR；(c)如果步骤(a)的荧光定量PCR可以得到阳性扩增并且步骤(b)的荧光定量PCR不能得到阳性扩增或ct值大于等于37、待测核酸中所述特异位点为突变前核酸，如果步骤(a)的荧光定量PCR可以得到阳性扩增并且步骤(b)的荧光定量PCR可以得到阳性扩增且ct值小于37、待测...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶品彬，石立立，张佩琢，
申请(专利权)人：苏州吉玛基因股份有限公司，上海吉玛制药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32