一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种ω‑芋螺毒素GVIA的制备方法，解决了现有技术合成ω‑芋螺毒素GVIA的空白和合成多肽中二硫键连接的准确率低、易生成多种同分异构体产物，增加产物分离纯化难度，从而使产物收率低的技术问题。本发明专利技术提供了一种ω‑芋螺毒素GVIA的制备方法，以Fmoc‑氨基树脂为固相合成的载体，依次缩合27个全保护氨基酸，全保护的氨基酸中Cys侧链分别采用Trt、Acm和Mob保护，得到ω‑芋螺毒素GVIA的线性全保护肽树脂，再依次脱除Cys的侧链保护基并进行环化反应定向形成二硫键，提高二硫键连接的准确率，得到的粗肽经纯化、冻干，得到ω‑芋螺毒素GVIA精肽。本发明专利技术广泛应用于多肽药物制备方法技术领域。

A method for the preparation of Omega conus toxin GVIA

The invention relates to a preparation method of Omega conotoxin GVIA, which solves the technical problem that the existing technology can synthesize the blank of Omega conotoxin GVIA and the low accuracy of the two sulfur bond connection in the synthetic polypeptide, easily generate a variety of isomer products, increase the difficulty of separation and purification of the products, and thus make the product low in yield. The invention provides a method for the preparation of Omega conamon GVIA, using Fmoc amino resin as a solid phase carrier, and successively condensation of 27 fully protected amino acids. The Cys side chains in all protected amino acids are protected by Trt, Acm and Mob respectively, and the linear full protective peptide resin of Omega conamin GVIA is obtained, and Cys is then removed in turn. The side chain protection group and the cyclization reaction orientated the two sulfur bond to improve the accuracy of the two sulfur bond connection. The obtained crude peptide was purified and freeze-dried, and the Omega cono toxin GVIA sperm peptide was obtained. The invention is widely applied to the technical field of polypeptide drug preparation.

【技术实现步骤摘要】
一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法
本专利技术涉及多肽药物合成制备
，特别涉及一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法。
技术介绍
芋螺毒素(conotoxin)是一类来源于芋螺毒液的生物活性多肽，由毒液管和毒囊内壁的毒腺所分泌，可引起动物出现惊厥、麻痹；通常由10～41个氨基酸残基组成，分子中含有两对或三对二硫键，是发现的最小核酸编码的动物神经毒素多肽。芋螺毒素能够特异性作用于乙酰胆碱受体及其它神经递质的各种受体亚型，以及钙、钠、钾等多种离子通道，可被用于受体和离子通道的鉴定与分类。这些特性使得芋螺毒素称为研究神经生物学和药理学的有效工具，并有助于新药的开发应用。根据作用于生物体靶标的不同，可将芋螺毒素分为α、ω、μ、δ等多种亚型。ω-芋螺毒素专一性的阻断神经末梢电压敏感型Ca2+通道，例如ω-芋螺毒素MVIIA和ω-芋螺毒素GVIA是N-型钙通道的强效、选择性阻滞剂。ω-芋螺毒素在抑制疼痛方面的作用，引起了研究人员的巨大兴趣，其中来源于幻芋螺(Conosmagus)的ω-芋螺毒素MVIIA，具有很好的镇痛效果，已被成功的开发成治疗严重慢性疼痛的药物齐考诺肽(商品名Prialt)。目前对齐考诺肽的合成研究已有很多报道，而对ω-芋螺毒素GVIA的合成则鲜有报道。ω-芋螺毒素GVIA是来自于地纹芋螺(C.geographus)的一种由27个氨基酸残基组成、C端酰胺化的多肽，其分子含有三对二硫键，其结构如下：专利CN101709082A报道了固相合成含有三对二硫键的齐考诺肽的制备方法，将全保护的线性肽树脂裂解得到的粗肽脱除Cys的侧链保护基，在液相中经一步氧化同时生成三对二硫键。由于6个Cys均采用Acm保护，不能定向形成二硫键，导致二硫键连接的准确率低，易生成多种同分异构体产物，增加产物分离纯化难度，从而使产物收率低。专利CN104974237A报道了固相合成三对二硫键的齐考诺肽的制备方法，首先将齐考诺肽分为A、B、C、D四个片段分别进行合成，再将四个片段依次连接得到全长的线性肽。在氨基酸缩合时氨基酸与树脂投料量的摩尔比值为2:1，在片段缩合时肽片段与肽树脂投料量的摩尔比值为3:1，导致原料的大量消耗，大大的增加了原料的投入成本；同时6个Cys均采用Trt保护，同样会导致二硫键连接的准确率低，产物收率低。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术的不足，依据ω-芋螺毒素GVIA自身结构特点，提供一种可定向生成ω-芋螺毒素的二硫键、合成产物副产物少、产物分离纯化简单且收率高的ω-芋螺毒素GVIA的制备方法。本专利技术解决技术问题所采用的技术方案是：一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法，依次包括步骤如下：1)缩合反应：在缩合体系中，采用固相合成法，以Fmoc保护的氨基树脂为载体，与全保护的氨基酸反应，逐步缩合氨基酸：按照ω-芋螺毒素GVIA主链肽序从C端至N端依次缩合27个活化后的全保护的氨基酸，得到线性全保护肽树脂；全保护的氨基酸中Cys侧链分别采用Trt、Acm和Mob保护；依次缩合保护氨基酸顺序为Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Mob)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Mob)-OH；合成的线性全保护肽树脂为：Cys(Mob)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Hyp(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Hyp(tBu)-Thr(OtBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Cys(Mob)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-Asn(Trt)-Hyp(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(OtBu)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-氨基树脂；2)脱除步骤1)制得的全保护肽树脂上Cys(Trt)的Trt保护基，环化，形成第一对二硫键，得一环肽树脂；3)脱除步骤2)制得的一环肽树脂上Cys(Acm)的Acm保护基，环化，形成第二对二硫键，得二环肽树脂；4)脱除步骤3)制得的二环肽树脂上Cys(Mob)的Mob保护基及剩余其它侧链保护基，裂解切割树脂，得到二环粗肽；5)对步骤4)制得的二环粗肽进行环化，形成第三对二硫键，得三环粗肽；6)将步骤5)制得的三环粗肽经纯化、冻干，得ω-芋螺毒素GVIA精肽。优选的，氨基树脂为：RinkAmide树脂、RinkAmideMBHA树脂、RinkAmideAM树脂、RinkAmideBHA树脂或Sieber树脂其中任何一种，氨基树脂替代度为0.1～1.2mmol/g。优选的，步骤1)中缩合体系为：A+D或A+B+C，其中A为HOBT或HOAT，B为HATU、HBTU、TBTU或PyBOP其中任何一种，C为DIEPA或TMP，D为DIC。优选的，步骤2)中脱除Trt保护基的方法为：在体积分数1％TFA-DCM溶液中，10～30℃条件下反应30～60min；环化方法为：加入体积分数10～20％DMSO，在10～30℃条件下反应2～6h。优选的，步骤3)中脱除Acm保护基环化方法为：加质量分数10％I2-MeOH溶液，在10～30℃条件下反应2～5h。优选的，步骤4)中裂解切割树脂的方法为：加入裂解切割试剂，在10～30℃条件下反应2～5h后，抽滤、乙醚沉降、冻干，得到二环粗肽；裂解切割试剂组成成分体积比为TFA:EDT:H2O:TIS＝94:2:2:2。优选的，步骤4)中脱除Mob保护基环化方法为：用体积分数10％乙酸将二环肽配成1mM的溶液，加入0.2M乙酸汞，调节pH至4，在10～30℃条件下反应2～5h后，加入体积分数20％的H2O2溶液，在10～30℃条件下反应2～5h。优选的，步骤5)中纯化方法为：用反相高效液相色潽法对粗肽进行纯化。优选的，纯化色潽法条件为：C18制备柱，流动相A相为体积分数0.1％TFA-H2O溶液，流动相B相为体积分数0.1％TFA-ACN溶液，梯度洗脱，流速80ml/min，洗脱时间60min，洗脱梯度流动相中B相体积百分数为10％～60％，紫外检测波长220nm，收集所需的组分。优选的，步骤1)中缩合步骤如下：a)Fmoc氨基树脂溶胀：向Fmoc氨基树脂中加入DCM或DMF本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ω‑芋螺毒素GVIA的制备方法，其特征在于，依次包括步骤如下：1)缩合反应：在缩合体系中，采用固相合成法，以Fmoc保护的氨基树脂为载体，与全保护的氨基酸反应，逐步缩合氨基酸：按照ω‑芋螺毒素GVIA主链肽序从C端至N端依次缩合27个活化后的全保护的氨基酸，得到线性全保护肽树脂；所述全保护的氨基酸中Cys侧链分别采用Trt、Acm和Mob保护；所述的依次缩合保护氨基酸顺序为Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH、Fmoc‑Cys(Trt)‑OH、Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH、Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑Thr(OtBu)‑OH、Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH、Fmoc‑Hyp(tBu)‑OH、Fmoc‑Asn(Trt)‑OH、Fmoc‑Cys(Acm)‑OHFmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH、Fmoc‑Cys(Mob)‑OH、Fmoc‑Cys(Trt)‑OH、Fmoc‑Asn(Trt)‑OH、Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Thr(OtBu)‑OH、Fmoc‑Hyp(tBu)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Cys(Acm)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Gly‑OH、Fmoc‑Hyp(tBu)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑Cys(Mob)‑OH；所述合成的线性全保护肽树脂为：Cys(Mob)‑Lys(Boc)‑Ser(tBu)‑Hyp(tBu)‑Gly‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑Cys(Acm)‑Ser(tBu)‑Hyp(tBu)‑Thr(OtBu)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Cys(Mob)‑Arg(Pbf)‑Ser(tBu)‑Cys(Acm)‑Asn(Trt)‑Hyp(tBu)‑Tyr(tBu)‑Thr(OtBu)‑Lys(Boc)‑Arg(Pbf)‑Cys(Trt)‑Tyr(tBu)‑氨基树脂；2)脱除步骤1)制得的全保护肽树脂上Cys(Trt)的Trt保护基，环化，形成第一对二硫键，得一环肽树脂；3)脱除步骤2)制得的一环肽树脂上Cys(Acm)的Acm保护基，环化，形成第二对二硫键，得二环肽树脂；4)脱除步骤3)制得的二环肽树脂上Cys(Mob)的Mob保护基及剩余其它侧链保护基，裂解切割树脂，得到二环粗肽；5)对步骤4)制得的二环粗肽进行环化，形成第三对二硫键，得三环粗肽；6)将步骤5)制得的三环粗肽经纯化、冻干，得ω‑芋螺毒素GVIA精肽。...

【技术特征摘要】
1.一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法，其特征在于，依次包括步骤如下：1)缩合反应：在缩合体系中，采用固相合成法，以Fmoc保护的氨基树脂为载体，与全保护的氨基酸反应，逐步缩合氨基酸：按照ω-芋螺毒素GVIA主链肽序从C端至N端依次缩合27个活化后的全保护的氨基酸，得到线性全保护肽树脂；所述全保护的氨基酸中Cys侧链分别采用Trt、Acm和Mob保护；所述的依次缩合保护氨基酸顺序为Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OHFmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Mob)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Mob)-OH；所述合成的线性全保护肽树脂为：Cys(Mob)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Hyp(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Hyp(tBu)-Thr(OtBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Cys(Mob)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-Asn(Trt)-Hyp(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(OtBu)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-氨基树脂；2)脱除步骤1)制得的全保护肽树脂上Cys(Trt)的Trt保护基，环化，形成第一对二硫键，得一环肽树脂；3)脱除步骤2)制得的一环肽树脂上Cys(Acm)的Acm保护基，环化，形成第二对二硫键，得二环肽树脂；4)脱除步骤3)制得的二环肽树脂上Cys(Mob)的Mob保护基及剩余其它侧链保护基，裂解切割树脂，得到二环粗肽；5)对步骤4)制得的二环粗肽进行环化，形成第三对二硫键，得三环粗肽；6)将步骤5)制得的三环粗肽经纯化、冻干，得ω-芋螺毒素GVIA精肽。2.根据权利要求1所述的一种ω-芋螺毒素GVIA的制备方法，其特征在于，所述的氨基树脂为：RinkAmide树脂、RinkAmideMBHA树脂、RinkAmideAM树脂、RinkAmideBHA树脂或Sieber树脂其中任何一种，所述氨基树脂替代度为0.1～1.2mmol/g。3.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：姬胜利，刘超，殷金岗，陈明鲁，
申请(专利权)人：润辉生物技术威海有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37