一种基于双酶信号级联放大的微小RNA-21超灵敏检测方法技术

本发明专利技术一种基于双酶信号级联放大的微小RNA‑21超灵敏检测方法；包括辣根过氧化物酶标探针的制备：采用EDC偶联羧基氨基的方法，通过DNA单链将羧基化聚苯乙烯微球与辣根过氧化物酶进行偶联；双链特异性核酸酶辅助靶标回收：双链特异性核酸酶特异性切割探针中与待检RNA互补配对的DNA单链，引发靶标循环反应，导致切割释放更多的辣根过氧化物酶，实现信号放大；辣根过氧化物酶信号放大：收集上清中切割释放的辣根过氧化物酶，加入TMB显色底物，通过颜色变化实现裸眼定性，通过吸光度值的变化实现酶标定量。该方案很好地区分微小RNA家族成员的差异，适合高危人群的社区肿瘤筛选，在生物医学研究和临床诊断中具有很大应用价值。

A super sensitive detection method for small RNA-21 based on double enzyme signal cascade amplification

A micro RNA 21 ultra sensitive detection method based on double enzyme signal cascade amplification, including the preparation of horseradish peroxidase labeled probe: coupling carboxyl polystyrene microspheres with horseradish peroxidase through DNA single strand and double chain specific nuclease assisted target recovery by EDC coupling carboxyl amino groups. The DNA single strand of double chain specific nuclease specific nuclease specific cutting probes, complementary to the pending RNA, triggering the target cycle reaction, leading to the release of more horseradish peroxidase and the realization of signal amplification; horseradish peroxidase signal amplification: the collection of horseradish peroxidase from the cleavage of the supernatant and the addition of TMB to the chromogenic substrate Through the color change, the naked eye is qualitatively determined, and the enzyme labeling is quantified by the change of absorbance. The scheme is well divided into small RNA family members, and the community tumor screening for high risk population is of great value in biomedical research and clinical diagnosis.

【技术实现步骤摘要】
一种基于双酶信号级联放大的微小RNA-21超灵敏检测方法
本专利技术涉及基因诊断
，更具体的是涉及一种新型基于双酶信号级联放大系统的微小RNA-21的超灵敏检测方法。
技术介绍
微小RNA(miRNA)是一种具有短长度(约22个核苷酸)的内源性非编码小分子，并与信使RNA结合以参与转录后水平的基因表达调控。大量的研究表明，微小RNA的异常表达与各种疾病，特别是人类肿瘤和癌症密切相关，例如miR-21在各种癌症中的存在过高表达。因此，作为重要肿瘤标志物的微小RNA可用于肿瘤的的诊断，治疗和预后，具有重要的临床意义。然而，由于其低浓度，小尺寸和高同源性等特征，实现其快速，简单，可靠和超灵敏的检测仍是一项巨大的挑战。双链特异性核酸酶是一种热稳定性核酸酶，能够选择性地切割降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA，而对RNA或者单链DNA几乎没有作用。此外，这种降解作用仅针对于至少12个完全匹配的核苷酸序列，因此它具有高度特异性。辣根过氧化物酶(HRP)是临床试验酶联免疫吸附测定(ELISA)中最常用的酶，具有分子量小，标记简单，性质稳定，活性高的优点。它可以氧化许多显色底物以产生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于双酶信号级联放大的微小RNA‑21超灵敏检测方法，其特征在于包括如下步骤：1)辣根过氧化物酶标探针的制备：采用EDC偶联羧基氨基的方法，通过DNA单链将羧基化聚苯乙烯微球与辣根过氧化物酶进行偶联；2)双链特异性核酸酶辅助靶标回收：双链特异性核酸酶特异性切割探针中与待检RNA互补配对的DNA单链，但保持待检RNA的完整性，引发靶标循环反应，导致切割释放更多的辣根过氧化物酶，实现信号放大；3)辣根过氧化物酶信号放大：收集上清中切割释放的辣根过氧化物酶，加入TMB显色底物，可通过颜色变化实现裸眼定性，通过吸光度值的变化实现酶标定量。

【技术特征摘要】
1.一种基于双酶信号级联放大的微小RNA-21超灵敏检测方法，其特征在于包括如下步骤：1)辣根过氧化物酶标探针的制备：采用EDC偶联羧基氨基的方法，通过DNA单链将羧基化聚苯乙烯微球与辣根过氧化物酶进行偶联；2)双链特异性核酸酶辅助靶标回收：双链特异性核酸酶特异性切割探针中与待检RNA互补配对的DNA单链，但保持待检RNA的完整性，引发靶标循环反应，导致切割释放更多的辣根过氧化物酶，实现信号放大；3)辣根过氧化物酶信号放大：收集上清中切割释放的辣根过氧化物酶，加入TMB显色底物，可通过颜色变化实现裸眼定性，通过吸光度值的变化实现酶标定量。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：辣根过氧化物酶标探针的制备具体如下：(1)将羧基化聚苯乙烯微球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液按照摩尔比为1：1～4比例混合于磷酸缓冲液中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应15～30分钟，然后加入DNA单链(一端氨基化一端羧基化)，室温下反应过夜；(2)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液至少清洗三次以除去未反应的单链DNA，得到DNA标记的探针；(3)将DNA标记的探针与辣根过氧化物酶按照摩尔比为1:100～600比例混合于磷酸缓冲液中，涡旋仪上旋转使其混匀，将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应2～3小时；(4)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBST缓冲液清洗多次以除去未反应的辣根过氧化物酶，最后用PBS清洗三次以除去PBST中的Tween-20,得到辣根过氧化物酶标记的探针。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：常津，彭伟盼，宫晓群，赵倩，朴佳芳，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12