一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法，包括：浓缩液制备、发酵、酶液制备、配制，选取溢油现场采集筛选出的小球藻经培养后浓缩，将扩大培养后的小球藻进行发酵，以超声破碎仪破壁后提取酶液，将小球藻浓缩液与小球藻酶液混合后添加稳定剂即为生物表面活性剂。有益效果为：制备方法简单易行，成本低廉，安全环保，不添加新的污染物质；从微藻中提取的生物表面活性剂，其表面张力、乳化活力、黏度等乳化指标较为稳定，同时生物表面活性剂具有低毒、环保、作用条件温和、污染物降解彻底等优点，对石油的降解能力较强，其降解指数可以达到73.68‑91.56%，是一种安全高效的生物表面活性剂。

A method for extracting biological surfactant from microalgae

The invention discloses a method of extracting bioactive agent from microalgae, including preparation, fermentation, enzyme preparation and preparation of concentrated liquid, and selecting Chlorella from the field of oil spill and concentrating after culture. When the algal concentrate is mixed with Chlorella enzyme solution, adding stabilizer is a kind of biological surfactant. The beneficial effects are: the preparation method is simple, low cost, safety and environmental protection, and no new contaminants are added; the surface tension, emulsification vigor and viscosity of the bioactive agents extracted from microalgae are more stable, and the biological surface active agent has low toxicity, environmental protection, mild conditions and pollution. The degradation ability of the oil is strong, and its degradation index can reach 73.68 and 91.56%. It is a safe and efficient bioactive agent.

【技术实现步骤摘要】
一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法
本专利技术涉及环境工程领域，尤其是涉及一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法。技术背景目前市面上多应用于溢油的产品有溢油分散剂、化油剂、消油剂等，其主要成分有：阴离子表面活性剂为主的醚型、非离子的酯型、原料来自农副产品、微毒的浓缩型。较之目前的化学表面活性剂合成产品，生物表面活性剂体现出诸多更益于研究发展的优点。生物表面活性剂作为天然表面活性剂的一种，其分子结构具有严格的亲水和疏水基团。它们不仅具备乳化分散油污及降低表面张力的功能，更有低毒、环保、作用条件温和、污染物降解彻底、生产工艺简单等优势。目前主要的生物表面活性剂为糖脂类，具体有：鼠李糖脂，槐糖脂，脂肽、脂蛋白，脂肽，短杆菌肽，多粘菌素，脂肪酸，中性脂肪和磷脂，磷脂质，多聚生物表面活性剂，多糖乳化剂，生物分散剂，甲壳素，聚酯肽链，其来源主要为细菌。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法，提取方法工艺简单，安全环保，生物表面活性剂具有低毒、环保、作用条件温和、污染物降解彻底的优点。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采取的技术方案为：一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法，包括：浓缩液制备、发酵、酶液制备、配制，具体包括以下步骤：浓缩液制备：取培养后的小球藻藻液1L，在0-4℃、3500-5000r/min条件下离心10-15分钟，去掉所得上清液，留沉淀；将沉淀用缓冲液重悬浮，再于之前离心条件进行离心，重复3-4次；将藻液离心出的所有藻液进行合并，并用缓冲液稀释，终体积为200-220mL，于0-4℃温度下储存备用；选取溢油现场采集筛选出的小球藻进行培养，经浓缩后其活性、生物降粘、石油烃降解等性能均得到大幅度提高；发酵：发酵培养基组成及其含量为：葡萄糖38-40g/L、玉米浆粉6-8g/L、蛋白胨4-5g/L、NaCl12.5-15.0g/L、(NH4)2SO41.65-1.70g/L、MgSO4·7H2O2.2-2.5g/L、KCl0.5-0.6g/L、KH2PO40.5-0.6g/L、CaCl20.1-0.12g/L，121-122℃条件下进行高压蒸汽灭菌15-30分钟，按照3.5-5.0%接种经培养后的小球藻，在温度为30-33℃、pH为6.9-7.2、搅拌速度为320-340r/min、通气量0.65-0.85vvm条件下发酵培养时间为72-96小时得发酵液；小球藻在充足的氮源、碳源、微量元素等必须物质条件下，小球藻能够迅速地恢复至活力巅峰的阶段，从而其脱氢酶、氧化酶、过氧化酶、石油降解酶、石化酶等有机降解相关酶加速分泌，为提取酶液、降解石油烃做准备；酶液制备：将发酵液在0-4℃、3500-5000r/min条件下离心10-15分钟，去掉所得上清液，留沉淀，将沉淀用缓冲液重悬浮后重复离心2-3次，合并沉淀；将沉淀溶于缓冲后用超声破碎仪破碎细胞，超声破碎仪功率为1.0-1.3kW，探头振幅为38-45%，温度为2-4℃，时间为30-48分钟；然后在0-4℃、11500-12000r/min条件下离心15-20分钟，留上清液，沉淀部分用缓冲液进行重悬浮，重复离心操作3-5次，合并上清液，低温浓缩至200-220mL后于0-4℃保存备用；选用超声破碎仪破碎小球藻，其破壁效果较好，不会对活性物质造成影响，不会添加新的污染物质，有利于进一步的离心提取；配制：将小球藻浓缩液与小球藻酶液，于3-4℃条件下按1:0.5-3.0的体积混合，混合液密封后，置于装有冰水的三角瓶中，在20-22℃、200-220r/min条件下振荡混合10-13分钟，以5-6:1的体积添加稳定剂，即得生物表面活性剂；从微藻中提取的生物表面活性剂，其表面张力、乳化活力、黏度等乳化指标较为稳定，同时生物表面活性剂具有低毒、环保、作用条件温和、污染物降解彻底等优点，对石油的降解能力较强，其降解指数可以达到73.68-91.56%，而且其制备方法简单易行，成本低廉，可以规模化应用于环境工程之中。作为优选，所用小球藻为从溢油现场采集筛选得出，经过驯化、传代，在石油的生物降粘、提高原油采收率、重油污染土壤的生物修复等均有显著成效。作为优选，缓冲液为pH为7.8-7.9的Tris-HCl缓冲溶液；Tris-HCl缓冲溶液不会使酶变性，同时有可以提纯酶，增大酶液中酶的含量。作为优选，稳定剂含量分别为，18-23%甘油、1.0-1.5mMEDTA与0.1-0.13mMDTT，其pH为7.5-7.7；稳定剂具有乳化的作用，增强生物表面活性剂的稳定性与均匀性。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1）其制备方法简单易行，成本低廉，安全环保，选用超声破碎仪破碎小球藻，其破壁效果较好，不会对活性物质造成影响，不会添加新的污染物质，有利于提高提取效率；2）从微藻中提取的生物表面活性剂，其表面张力、乳化活力、黏度等乳化指标较为稳定，同时生物表面活性剂具有低毒、环保、作用条件温和、污染物降解彻底等优点，对石油的降解能力较强，其降解指数可以达到73.68-91.56%，是一种安全高效的生物表面活性剂。附图说明图1是本专利技术一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法的工艺流程图。具体实施方式下面通过附图和实施例对本专利技术方案作进一步说明：实施例1：一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法，包括：浓缩液制备、发酵、酶液制备、配制，具体包括以下步骤：浓缩液制备：取培养后的小球藻藻液1L，在4℃、5000r/min条件下离心15分钟，去掉所得上清液，留沉淀；将沉淀用缓冲液重悬浮，再于之前离心条件进行离心，重复4次；将藻液离心出的所有藻液进行合并，并用缓冲液稀释，终体积为220mL，于4℃温度下储存备用；选取溢油现场采集筛选出的小球藻进行培养，经浓缩后其活性、生物降粘、石油烃降解等性能均得到大幅度提高；发酵：发酵培养基组成及其含量为：葡萄糖40g/L、玉米浆粉8g/L、蛋白胨5g/L、NaCl15.0g/L、(NH4)2SO41.70g/L、MgSO4·7H2O2.5g/L、KCl0.6g/L、KH2PO40.6g/L、CaCl20.12g/L，122℃条件下进行高压蒸汽灭菌30分钟，按照5.0%接种经培养后的小球藻，在温度为33℃、pH为7.2、搅拌速度为340r/min、通气量0.85vvm条件下发酵培养时间为96小时得发酵液；小球藻在充足的氮源、碳源、微量元素等必须物质条件下，小球藻能够迅速地恢复至活力巅峰的阶段，从而其脱氢酶、氧化酶、过氧化酶、石油降解酶、石化酶等有机降解相关酶加速分泌，为提取酶液、降解石油烃做准备；酶液制备：将发酵液在4℃、5000r/min条件下离心15分钟，去掉所得上清液，留沉淀，将沉淀用缓冲液重悬浮后重复离心3次，合并沉淀；将沉淀溶于缓冲后用超声破碎仪破碎细胞，超声破碎仪功率为1.3kW，探头振幅为45%，温度为4℃，时间为48分钟；然后在4℃、12000r/min条件下离心20分钟，留上清液，沉淀部分用缓冲液进行重悬浮，重复离心操作5次，合并上清液，低温浓缩至220mL后于4℃保存备用；选用超声破碎仪破碎小球藻，其破壁效果较好，不会对活性物质造成影响，不会添加新的污染物质，有利于进一步的离心提取；配制：将小球藻浓缩液与小球藻酶液，于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法，包括以下步骤：浓缩液制备：取培养后的小球藻藻液1L，离心10‑15分钟，去掉所得上清液，留沉淀；将沉淀用缓冲液重悬浮，重复离心3‑4次；将离心出的所有藻液进行合并，并用缓冲液稀释，终体积为200‑220mL，于0‑4℃温度下储存备用；发酵：按照3.5‑5.0%接种经培养后的小球藻，发酵72‑96小时得发酵液；酶液制备：将发酵液在0‑4℃、3500‑5000r/min条件下离心10‑15分钟，将沉淀用缓冲液重悬浮后重复离心2‑3次，合并沉淀；将沉淀溶于缓冲后用超声破碎仪破碎细胞，离心后留上清液，沉淀部分用缓冲液进行重悬浮，重复离心3‑5次合并上清液，低温浓缩至200‑220mL后于0‑4℃保存备用；配制：于3‑4℃条件下，将小球藻浓缩液与小球藻酶液按1:0.5‑3.0的体积混合，混合液密封后，置于装有冰水的三角瓶中，在20‑22℃、200‑220r/min条件下振荡混合10‑13分钟，以5‑6:1的体积添加稳定剂，即得生物表面活性剂。

【技术特征摘要】
1.一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法，包括以下步骤：浓缩液制备：取培养后的小球藻藻液1L，离心10-15分钟，去掉所得上清液，留沉淀；将沉淀用缓冲液重悬浮，重复离心3-4次；将离心出的所有藻液进行合并，并用缓冲液稀释，终体积为200-220mL，于0-4℃温度下储存备用；发酵：按照3.5-5.0%接种经培养后的小球藻，发酵72-96小时得发酵液；酶液制备：将发酵液在0-4℃、3500-5000r/min条件下离心10-15分钟，将沉淀用缓冲液重悬浮后重复离心2-3次，合并沉淀；将沉淀溶于缓冲后用超声破碎仪破碎细胞，离心后留上清液，沉淀部分用缓冲液进行重悬浮，重复离心3-5次合并上清液，低温浓缩至200-220mL后于0-4℃保存备用；配制：于3-4℃条件下，将小球藻浓缩液与小球藻酶液按1:0.5-3.0的体积混合，混合液密封后，置于装有冰水的三角瓶中，在20-22℃、200-220r/min条件下振荡混合10-13分钟，以5-6:1的体积添加稳定剂，即得生物表面活性剂。2.根据权利要求1所述的一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法，其特征在于：所述浓缩液制备步骤中的离心温度为0-4℃，转速为3500-5000r/min。3.根据权利要求1所述的一种从微藻中提取生物表面活性剂的方法，其特征在于：所述浓缩液制备步骤中的缓冲液为pH为7.8-7.9的Tris-HCl缓冲溶液。4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈庆国，李晶晶，鲍博，刘梅，穆军，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33