一种冰缘植物抗冻基因及其用于制备抗冻转基因植物应用制造技术

本发明专利技术提供了一种高山离子芥抗冻基因CbDREB2AL、其编码产物CbDREB2AL蛋白、含有抗冻基因CbDREB2AL的植物的制备方法及其在制备抗冻转基因植物中的应用。本发明专利技术公开的CbDREB2AL基因可应用到转基因作物育种中以提高其抗冻性，具有广阔的应用前景。

A freeze resistant gene from periglacial plants and its application in the preparation of antifreeze transgenic plants

The invention provides a method for preparing Alpine ion mustard antifreeze gene CbDREB2AL, its encoding product CbDREB2AL protein, a plant containing antifreeze gene CbDREB2AL and its application in the preparation of antifreeze transgenic plants. The CbDREB2AL gene disclosed in the invention can be applied to the breeding of transgenic crops so as to improve its frost resistance and has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种冰缘植物抗冻基因及其用于制备抗冻转基因植物应用
本专利技术属于生物
，特别涉及一种高山离子芥抗冻基因CbDREB2AL、其编码产物CbDREB2AL蛋白、含有抗冻基因CbDREB2AL的植物的制备方法及其在制备抗冻转基因植物中的应用。
技术介绍
低温是影响植物地理分布和生长季节的最主要的环境因素之一，低温冻害严重地影响着农作物的生长状况和产量，大量的研究表明，冷响应基因的表达对植物的抗冻有着至关重要的作用。冷响应基因编码种类繁多的蛋白，如植物呼吸、碳循环、脂类、苯丙素和抗氧化代谢过程相关的酶，还有调控基因表达的转录因子，抗冻蛋白等[1-3]。高山离子芥(Chorisporabungeana，又名Chorisporaexscapa)是十字花科离子芥属多年生草本植物，分布在高海拔亚高山草甸和砾石质山坡上，该地区的环境特点是气候寒冷、干旱、强辐射。恶劣环境时常造成高山离子芥低温胁迫。高山离子芥为了适应低温、强紫外、大风和干旱等不利的环境条件，进化出了优秀的逆境适应机制[4]。本专利技术公开了一种冷响应基因CbDREB2AL，该基因编码高山离子芥一个新的受低温诱导而产生的蛋白CbDREB2AL。该基因编码的蛋白与山萮菜(Es)、天蓝遏蓝菜(Nc)、琴叶拟南芥(Al)、拟南芥(At)以及花生(Ah)的同源基因有较近的亲缘关系。本专利技术公开的CbDREB2AL基因可应用到转基因作物育种中以提高其抗冻性，具有广阔的应用前景。1.Chinnusamy,V.,J.K.Zhu,andR.Sunkar,Generegulationduringcoldstressacclimationinplants.Methodsinmolecularbiology,2010.639:p.39-55.2.Yadav,S.K.,Coldstresstolerancemechanismsinplants.Areview.Agron.Sustain.Dev.,2010.30(3):p.515-527.3.Thomashow,M.F.,PLANTCOLDACCLIMATION:FreezingToleranceGenesandRegulatoryMechanisms.AnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMolecularBiology,1999.50(1):p.571-599.4.Zhao,Z.,etal.,Deep-sequencingtranscriptomeanalysisofchillingtolerancemechanismsofasubnivalalpineplant,Chorisporabungeana.BMCPlantBiology,2012.12(1):p.222.
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗冻基因CbDREB2AL及其编码蛋白。本专利技术的另一个目的在于提供一种培育抗冻转基因植物的方法，是将所述的编码基因转入植物中，得到具有抗冻特性的转基因植物。本专利技术的又一个目的在于提供一种由所述抗冻基因CbDREB2AL用于转化植物以产生抗冻转基因植物的用途。含有本专利技术基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本专利技术的保护范围。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术克隆了高山离子芥的抗冻基因CbDREB2AL，所述抗冻基因CbDREB2AL具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，其中，列表中的SEQIDNO：1由1002个碱基组成。该抗冻基因CbDREB2AL能够编码CbDREB2AL蛋白，此种蛋白具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，其中，列表中的SEQIDNO：2由334个氨基酸组成。本专利技术中CbDREB2AL基因编码的蛋白与双子叶植物山萮菜(Es)、天蓝遏蓝菜(Nc)、琴叶拟南芥(Al)、拟南芥(At)以及花生(Ah)等的同源基因具有较近的亲缘关系。可用现有的植物表达载体构建含有CbDREB2AL基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如PMDC32、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。携带有本专利技术基因CbDREB2AL的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的宿主植物可以是拟南芥、烟草等双子叶植物。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GFP基因、GUS基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除芳剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。本专利技术所提供的获得抗冻的转基因植物的方法，是将上述植物抗冻蛋白的编码基因CbDREB2AL导入植物中，得到抗冻转基因植物。本专利技术将CbDREB2AL基因的cDNA构建在CaMV35s启动子下游，得到表达载体(其图谱如图2所示)，利用电击转化的方法即得到含有该表达载体的农杆菌菌株，利用浸花法转染野生型拟南芥得到过表达的转基因植株。所述植物可为双子叶植物，如烟草、拟南芥等。本专利技术通过对比试验验证了含有CbDREB2AL基因的转基因植株具有抗冻特性，图3和图4中的结果显示，CbDREB2AL的过表达可以显著增强拟南芥的抗冻特性，使低温处理之后的拟南芥的存活率提高了20％左右。这对于培养优良的作物品种特别是抗冻作物品种具有重要的理论及实践意义。附图说明图1高山离子芥CbDREB2AL蛋白的氨基酸序列经同源性比对，利用MEGA软件分析的进化关系。图2构建的过表达载体图谱，PMDC32-CbDREB2AL。图3对照(野生型WT为Col-0)和转基因植株(#2，#3)抗冻性表型比较。图4对照(野生型WT为Col-0)和转基因植株(#2，#3)低温处理后的存活率比较。具体实施方式下面结合具体实施例进一步详细描述本专利技术的技术方案，但本专利技术的保护范围不局限于以下所述。在本专利技术的下述实施例中，所用的实验材料为高山离子芥(Chorisporabungeana，又名Chorisporaexscapa)(西部地区特色植物种质资源库平台)和拟南芥Col-0(Arabidopsisthaliana，Col-0)(美国拟南芥生物资源中心)，农杆菌GV3101(普如汀生物技术有限公司),质粒PMDC32(美国拟南芥生物资源中心)。实施例1高山离子芥抗冻蛋白编码基因CbDREB2AL序列的克隆：利用RNA提取分离试剂(Trizol，Invitrogen)分离高山离子芥再生苗总RNA，其具体方法是：收集高山离子芥再生苗100mg，立即置于液氮中研磨成粉末，之后加入1mlTrizol试剂，充分混匀，吸入到一个1.5ml的离心管中；室温放置5min；加入0.2ml新鲜氯仿，剧烈振摇15s，室温静置3min；4℃，12000g离心15min；上清转移到一个新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇混匀，4℃，12000g离心10min沉淀RNA；RNA沉淀用1ml75％乙醇洗涤后溶于适量DEPC处理过的水中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高山离子芥抗冻基因CbDREB2AL，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种高山离子芥抗冻基因CbDREB2AL，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种由权利要求1所述的抗冻基因CbDREB2AL编码的蛋白质CbDREB2AL，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.一种含有如权利要求1所述的抗冻基因CbDREB2AL的表达载体。4.一种含有如权利要求1所述的抗冻基因CbDREB2AL的细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳修乐，安黎哲，张国艳，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62