植物花青素合成控制基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了植物花青素合成控制基因及其应用。所公开的基因序列如SEQ ID No.1所示。该基因在白色结球大白菜的第一个内含子中存在一个3772bp大小的大片段的插入突变、其gDNA序列如SEQ ID No.5所示。根据该基因的gDNA核苷酸序列中内含子中的突变设计了Marker1，Marker2，Marker8三对特异性PCR引物，其中Marker1和Marker2为共显性标记，Marker8为母性标记。通过对目标大白菜的DNA进行PCR扩增、经琼脂糖凝胶电泳鉴定，Marker1和Marker2能快速鉴定出分离群体中的紫心杂合株和纯合株，结合叶球性状，Marker8亦可以区分出分离群体的紫心杂合和纯合株。

Plant anthocyanin synthesis control gene and its application

The invention discloses a plant anthocyanin synthesis control gene and its application. The published gene sequences are shown by the SEQ ID No.1. The gene is inserted in the first intron of white heading Chinese cabbage with a large 3772bp fragment, and its gDNA sequence is shown as SEQ ID No.5. According to the mutation of the intron in the gDNA nucleotide sequence of the gene, the specific PCR primers were designed for Marker1, Marker2, and Marker8 three, of which Marker1 and Marker2 were co dominant markers, and Marker8 was a maternal marker. The DNA of Chinese cabbage was amplified by PCR and identified by agarose gel electrophoresis. Marker1 and Marker2 could quickly identify the purple heart heterozygous and homozygous strains in the isolated population. In combination with the leaf ball traits, Marker8 could also distinguish the purple heart heterozygous and homozygous strains of the separated populations.

【技术实现步骤摘要】
植物花青素合成控制基因及其应用
本专利技术属于蔬菜育种及分子遗传学领域，具体涉及控制紫心大白菜紫色性状的基因、分子标记及其应用。
技术介绍
大白菜(BrassicarapaL.)属十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种，是起源于我国的主要蔬菜作物之一，也是我国种植面积最大的蔬菜作物之一，与人们的日常生活健康密切相关。随着人们生活水平的提高，近年来，人们对大白菜品质的要求日益提高，橙色、紫色大白菜育种受到越来越多国内外学者和育种家的重视。紫色大白菜由于花青素含量丰富，不仅有利于提高白菜类作物自身的抗逆能力，而且对于人类健康的营养价值极高，其具有抗癌、抗氧化及心血管疾病的功效受到国内外的广泛关注。但是，紫心大白菜叶球颜色需要在其结球成熟后才能表现出，而且需要在田间切开叶球逐株观察，操作起来不仅对种质材料的破坏性极大，而且费时费力，极大的延缓了育种进程。因此克隆控制大白菜紫色叶球的基因、研究其简单准确的检测方法对于创新种质资源、加快育种步伐显得十分重要。申请人采用图位克隆和候选基因基因差异表达分析方法，结合大白菜的测序结果，筛选克隆了控制大白菜紫色叶球的基因、并根据该基因的序列差异开发了与大白菜叶球紫色基因共分离的分子标记和显性标记，为进行紫色叶球大白菜形成分子机理及分子辅助育种，加快育种进程奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术提供了植物花青素合成控制基因。本专利技术提供的植物花青素合成控制基因的序列为：(1)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或(2)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或(3)与(1)或(2)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。本专利技术还提供了表达盒、表达载体、克隆载体或工程菌，其包括包含本专利技术的核酸。本专利技术的基因在植物中合成花青素中的应用，所述植物包括：大白菜、不结球白菜、拟南芥等各种植物。本专利技术又提供了转基因植物的构建方法，其利用基因工程手段，在目标植物中过表达本专利技术的基因，筛选阳性转基因植株。本专利技术同时提供了与大白菜花青素合成基因相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记中包含一个3772bp片段的插入突变、其gDNA序列如SEQIDNo.5所示。本专利技术又提供了用于鉴定紫心大白菜材料的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有用于扩增权利要求5所述分子标记的上游引物和下游引物：上游引物：5’-ATGGAGGGTTCGTCCCAAG-3’下游引物：5’-TCAAGTTCCAGTTTCTCCATCC-3’。本专利技术还提供了用于鉴定紫心大白菜材料的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有用于扩增权利要求5所述分子标记的上游引物和下游引物：Marker1-F：5’-TGGTGTACTTTGATCCTTCGTG-3’Marker1-R：5’-ACTGCATTCGCGTCTCCTAC-3’Marker2-F：5’-CTTTTCTGCACGAACCCG-3’Marker2-R：5’-ATTCGCGTCTCCTACTCCATAT-3’Marker8-F：5’-AAAAGGTGCATGGACTGCT-3’Marker8-R：5’-TGTTTTGGTGTCGATGAAGAAG-3’。本专利技术的分子标记在紫色大白菜分子标记辅助育种中的应用。本专利技术的分子标记在鉴定紫色大白菜材料中的应用。在本专利技术研究中，专利技术人设计的特异性PCR引物和检测方法，不仅能对大白菜苗期所提取的DNA进行PCR扩增，还能用于大量筛选大白菜种质资源。该PCR引物是利用引物设计软件Primer5.0，以紫心大白菜的BrMYB2基因及其等位基因之间的序列差异为基础设计的。根据扩增条带的有无和长短大小能快速检测到含有此基因的大白菜品种和种质资源，其检测的准确性高，操作简单，成本低廉。若一个大白菜品种或种质资源中含有此基因，则用上述引物能够扩增出长度为5442bp或者1665bp的特异性片段，其中大带为具有白色叶球遗传背景的植株，小带则为具有紫色叶球遗传背景的植株。本专利技术获得了一个大白菜控制紫心叶球性状(/与花青素合成相关)基因序列及其快速检测是否含有该基因以及其等位基因的检测方法。开发了两对可以在苗期就进行杂合株鉴定的共显性标记，以及一对在球期结合叶球性状鉴定杂合株的偏母性标记，并且利用该方法可以快速检测含有该基因的大白菜植株，其检测准确性高，操作简单，成本低廉。使得在紫色大白菜种质资源中大量的筛选和鉴定基因型成为可能，也可以作为标记性状在紫心大白菜杂交种纯度鉴定中应用。通过本专利技术得到的一组控制紫心大白菜紫色性状的等位基因(BrMYB2和Brmyb2)，可用于紫心大白菜花青素合成分子机制的机理研究。附图说明图1为本专利技术的BrMYB2/Brmyb2基因特异性PCR引物在cDNA中扩增结果。W代表含有Brmyb2基因的白球大白菜PCR扩增产物，P代表含有BrMYB2基因的紫心大白菜的扩增产物，M代表含有BrMYB2基因的紫菜薹亲本的扩增产物；M1为DNAladder。图2为BrMYB2/Brmyb2基因在gDNA中扩增结果，含有BrMYB2基因的普通大白菜扩增出一条1665bp的条带，而含有Brmyb2基因的紫心大白菜则扩增出一条5442bp的条带。W代表含有Brmyb2基因的白球大白菜PCR扩增产物，P代表含有BrMYB2基因的紫心大白菜的扩增产物，M代表含有BrMYB2基因的紫菜薹亲本的扩增产物；M1为DNAladder；M2为DNAladder。图3为Marker1和Marker2扩增出的共显性标记，含有BrMYB2基因的大白菜扩增出一条约300bp的条带(Marker1为306bp，Marker2为348bp)，而含有Brmyb2基因的大白菜则扩增出一条大约4000bp的条带(Marker1为4081bp，Marker2为4123bp)。而杂合株该两对标记都可以扩增出两种大小的条带。W代表含有Brmyb2基因的白球大白菜PCR扩增产物，P代表含有BrMYB2基因的紫心大白菜的扩增产物，W+P代表杂合紫心大白菜的扩增产物。图4为Marker8扩增出的显性标记，含有Brmyb2基因的大白菜则扩增出一条972bp的条带，而含有BrMYB2基因的大白菜无特异的扩增产物。如果具有紫色叶球性状的大白菜也可以扩增出该条带，则说明该植株为杂合株；W代表含有Brmyb2基因的白球大白菜PCR扩增产物，P代表含有BrMYB2基因的紫心大白菜的扩增产物，W+P代表杂合紫心大白菜的扩增产物。具体实施方式以下实施例所用材料：紫心大白菜株系11S96(段岩娇，张鲁刚，何琼，张明科，石姜超.紫心大白菜花青素积累特性及相关基因表达分析[J].园艺学报,2012Vol.39(11):2159-2167)是经过亚种间杂交，并多代自交育成的各种农艺性状稳定的品系。专利技术人在研究中将此品系与橙色大白菜“14S162”(14S162是由橙色大白菜‘S941-6’多代单株自交选择而来，‘S941-6’公开于ZL200610104743.9)为母本杂交产生的F1群体，然后通过单株自交获得相应的F2群体。在F2群体中，选择有紫色、无紫色各10株建DNA池,采用BSA法在全基因组筛选紧密连锁分子标记，本文档来自技高网...

【技术保护点】
植物花青素合成控制基因，其特征在于，该基因的序列为：(1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或(2)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或(3)与(1)或(2)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.植物花青素合成控制基因，其特征在于，该基因的序列为：(1)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或(2)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或(3)与(1)或(2)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。2.表达盒、表达载体、克隆载体或工程菌，其包括包含权利要求1所述的核酸。3.权利要求1所述基因在植物中合成花青素中的应用，所述植物包括：大白菜、不结球大白菜、拟南芥。4.一种转基因植物的构建方法，其特征在于，利用基因工程手段，在目标植物中过表达权利要求1所述基因，筛选阳性转基因植株。5.与大白菜花青素合成基因相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记中包含一个3772bp片段的插入突变、其gDNA序列如SEQIDNo.5所示。6.用于鉴定紫心大白菜材料的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有用于扩增权利要求5所述分子标记的上游引物和下游引物：上游引物：5’-ATGGAGGGTTCGTCCCAAG-3’下游引...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鲁刚，何琼，薛一花，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61