一种甲氨蝶呤前药及其双靶向纳米粒子的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种甲氨蝶呤前药及其双靶向纳米粒子的制备方法，将透明质酸溶于第一有机溶剂，十八胺溶于第二有机溶剂，在有活化剂存在的情况下混合反应得到透明质酸‑十八胺结合物；透明质酸‑十八胺结合物溶于第三有机溶剂，再将溶于第三有机溶剂的活化的甲氨蝶呤加入其中，反应得到甲氨蝶呤‑透明质酸‑十八胺结合物，即为甲氨蝶呤前药。然后将甲氨蝶呤前药加入去离子水中，冰浴中超声自组装成甲氨蝶呤前药双靶向纳米粒子，为粒径60～120nm的球形，在水中稳定性好，甲氨蝶呤既起治疗作用又起靶向作用，透明质酸起着靶向配体的作用，使得该甲氨蝶呤前药双靶向纳米粒子具有靶向和协同治疗的效果，具有广泛的应用前景。

Preparation of methotrexate prodrug and its dual targeting nanoparticles

The invention discloses a preparation method of methotrexate prodrug and two target nanoparticles, dissolving hyaluronic acid in the first organic solvent, dissolving eighteen amines in second organic solvent and mixing the hyaluronic acid eighteen amine conjugate under the presence of activator, and dissolving third diamine acid eighteen amine conjugate in third. The organic solvent is added to the activated methotrexate, which is dissolved in the third organic solvent, and reacts to the methotrexate hyaluronic acid eighteen amine conjugate, that is, the methotrexate prodrug. Then the methotrexate prodrug was added to the deionized water, and the ice bath was assembled into a double target nanoparticle of methotrexate. It was a spherical particle with a particle size of 60 to 120nm. It had good stability in water. The methotrexate played both therapeutic and target roles. Hyaluronic acid played the role of targeted coordination and made the methotrexate prodrug double. Targeting nanoparticles have targeted and synergistic therapeutic effects, and have wide application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种甲氨蝶呤前药及其双靶向纳米粒子的制备方法
本专利技术属于医药类抗肿瘤及抗风湿药物制剂领域，具体涉及一种甲氨蝶呤前药及其双靶向纳米粒子的制备方法。
技术介绍
甲氨蝶呤(MTX)是一种叶酸类抗代谢药剂，能与肿瘤细胞表面的叶酸受体结合，起到很好的靶向作用，常用于各种恶性肿瘤治疗，也是常用的抗风湿药物。MTX在药用上也有许多不利之处，其可增加肝肾功能毒性，且由于药物作用机理是作用在肿瘤细胞的细胞质而非细胞核，通过对二氢叶酸还原酶的抑制而达到阻碍肿瘤细胞DNA合成的目的，所以对正常的生物细胞也有药物作用，毒副作用加大。透明质酸(HA)是一种天然的生物大分子物质，广泛存在于关节滑液和细胞间质中，具有良好的生物相容性、可生物降解、无毒、无免疫原性、化学修饰多样性等优点，并且，透明质酸受体在多种肿瘤细胞高度表达，利用配体-受体相互作用，透明质酸可以靶向肿瘤细胞过度表达的CD44受体，提高肿瘤治疗效果，因此被广泛用于抗癌药物的传递。天然HA在机体内很容易降解，作为药品或生物材料在体内的存留时间较短，阻碍了它在新型生物材料方面的开发和应用。对HA进行化学修饰后，不仅提高了HA抗透明质酸酶降解的能力，还赋予了HA其他特别的性质，扩大了HA的应用领域。纳米粒子作为药物载体进入体内，可以有效地减少人体网状内皮系统(RES)巨噬细胞的吞噬，作为纳米级的粒子能穿越细胞间隙，可通过人体最小的毛细血管及血脑屏障(BBB)，并被细胞组织吸收，纳米粒子药物载体可以控制药物在靶向部位释放、减少药物用量、增强药物疗效并降低药物毒性。同时，粒子系统可以避免药物活性丧失，有利于药物的储藏和运输。纳米粒子的诸多优点，使其成为一种很有前途的药物新剂型。甲氨蝶呤和透明质酸的靶向性都有一定的限度，将二者一起作用势必会增加载体靶向性，但目前还没有将二者结合制备双靶向制剂或制备纳米粒子药物载体的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种甲氨蝶呤前药及其双靶向纳米粒子的制备方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之一是：一种甲氨蝶呤前药的制备方法，包括：1)将透明质酸(HA)溶于第一有机溶剂中，20～40℃下加热至透明质酸溶解后冷却到室温，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌反应至少1h；将十八胺(OCA)溶于第二有机溶剂后，加入至上述溶液中；所述十八胺与透明质酸单体的摩尔比为5:1～1:1；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与透明质酸单体的摩尔比、N-羟基琥珀酰亚胺与透明质酸单体的摩尔比均为8:1～1:1；然后在隔绝氧气的条件下，55～65℃搅拌至少5h，再在室温下搅拌22～26h；得到的混合溶液用体积比1:3～1:1的水-乙醇混合液透析45～50h，再用水透析45～50h，过滤，冷冻干燥，得到透明质酸-十八胺结合物(HA-OCA)；2)将甲氨蝶呤(MTX)溶于第三有机溶剂中，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，搅拌反应至少30min；将步骤1)得到的透明质酸-十八胺结合物溶于第三有机溶剂后，加入至上述溶液中；所述甲氨蝶呤与透明质酸-十八胺结合物中的透明质酸单体的摩尔比为5:1～1:1；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与甲氨蝶呤的摩尔比、4-二甲氨基吡啶与甲氨蝶呤的摩尔比均为4:1～1:1；然后避光、室温反应45～50h，用水透析45～50h，冷冻干燥，得到甲氨蝶呤前药，为甲氨蝶呤-透明质酸-十八胺结合物(MTX-HA-OCA)。一实施例中：所述第一有机溶剂为无水甲酰胺、水中的至少一种。一实施例中：所述第二有机溶剂为二甲基甲酰胺、乙醇中的至少一种。一实施例中：所述第三有机溶剂为四氢呋喃、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、无水甲酰胺、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮中的至少一种。一实施例中：所述透析采用的透析袋的截留分子量为1000～10000。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之二是：一种根据上述的制备方法所制备的甲氨蝶呤前药。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之三是：一种甲氨蝶呤前药的双靶向纳米粒子的制备方法，包括：根据上述的制备方法制备得到甲氨蝶呤-透明质酸-十八胺结合物，将其分散于水中，-5～5℃下超声处理，再在室温下搅拌22～26h，自组装得到甲氨蝶呤-透明质酸-十八胺双靶向纳米粒子分散液，即为甲氨蝶呤前药的双靶向纳米粒子。一实施例中：所述超声处理的功率为100～300W，持续时间为3～6s，间隔时间为2～4s。一实施例中：所述超声处理的时间为8～20min。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之四是：一种根据上述的制备方法所制备的甲氨蝶呤前药的双靶向纳米粒子，所述甲氨蝶呤前药的双靶向纳米粒子为球形，粒径为60～120nm。本技术方案与
技术介绍
相比，它具有如下优点：本专利技术通过化学连接甲氨蝶呤、透明质酸和十八胺制备甲氨蝶呤前药及其双靶向缓释纳米粒子，十八胺在自组装过程中形成胶束的疏水性内核，药物兼靶向分子的甲氨蝶呤作为MTX-HA-OCA分子的亲水端形成胶束的亲水外壳，使得纳米粒子在水中稳定性好，平均粒径为100nm左右，适合作为静脉注射制剂，甲氨蝶呤既起治疗作用又起靶向作用，透明质酸起着靶向配体的作用，具有双靶向、靶向性强、缓释、长循环、低毒性和协同治疗以增强疗效的特点，在抗肿瘤、抗风湿等医药领域具有广泛的应用前景。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。图1为MTX-HA-OCA双靶向纳米粒子的合成路线图。图2为MTX-HA-OCA双靶向纳米粒子的傅里叶变换红外表征图谱。图3为MTX-HA-OCA双靶向纳米粒子的400MHz核磁氢谱表征图。图4为MTX-HA-OCA双靶向纳米粒子的粒径分布图。图5为MTX-HA-OCA双靶向纳米粒子的Zeta电位分布图。图6为MTX-HA-OCA双靶向纳米粒子的透射电镜图。具体实施方式下面通过实施例具体说明本专利技术的内容：实施例11)称取100mg分子量为8000Da的透明质酸(透明质酸单体的分子量为776.65)，加入5mL无水甲酰胺，缓慢加热至20～40℃至透明质酸溶解后冷却到室温，再加96mgEDC和58mgNHS搅拌活化2h；将75mg十八胺溶于7mL二甲基甲酰胺，并缓慢加到上述活化的透明质酸溶液中，在氩气保护下60℃下搅拌12h，再在室温下搅拌24h；得到的混合溶液依次用体积比1:3、1:2、1:1的去离子水-乙醇混合液梯度透析48h，每一梯度透析时间依次为6h、18h、24h，再用去离子水透析48h，透析采用的透析袋的截留分子量为3500；透析完成后过滤，真空冷冻干燥，得到透明质酸-十八胺结合物(HA-OCA)；2)称取84mg甲氨蝶呤溶于5mL二甲基亚砜，加入84mgEDC、84mgDMAP，轻微搅拌活化30min；把114mg的HA-OCA溶于10mL无水甲酰胺，加到上述活化的甲氨蝶呤溶液中，避光，室温下搅拌反应48h，然后用去离子水透析48h，透析采用的透析袋的截留分子量为3500，真空冷冻干燥，得到甲氨蝶呤前药，为甲氨蝶呤-透明质酸-十八胺结合物(MTX-HA-OCA)；3)将所得甲氨蝶呤-透明质酸-十八胺结合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甲氨蝶呤前药的制备方法，其特征在于：包括：1)将透明质酸溶于第一有机溶剂中，20～40℃下加热至透明质酸溶解后冷却到室温，再加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应至少1h；将十八胺溶于第二有机溶剂后，加入至上述溶液中；所述十八胺与透明质酸单体的摩尔比为5:1～1:1；所述1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺与透明质酸单体的摩尔比、N‑羟基琥珀酰亚胺与透明质酸单体的摩尔比均为8:1～1:1；然后在隔绝氧气的条件下，55～65℃搅拌至少5h，再在室温下搅拌22～26h；得到的混合溶液用体积比1:3～1:1的水‑乙醇混合液透析45～50h，再用水透析45～50h，过滤，冷冻干燥，得到透明质酸‑十八胺结合物；2)将甲氨蝶呤溶于第三有机溶剂中，再加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和4‑二甲氨基吡啶，搅拌反应至少30min；将步骤1)得到的透明质酸‑十八胺结合物溶于第三有机溶剂后，加入至上述溶液中；所述甲氨蝶呤与透明质酸‑十八胺结合物中的透明质酸单体的摩尔比为5:1～1:1；所述1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺与甲氨蝶呤的摩尔比、4‑二甲氨基吡啶与甲氨蝶呤的摩尔比均为4:1～1:1；然后避光、室温反应45～50h，用水透析45～50h，冷冻干燥，得到甲氨蝶呤前药，为甲氨蝶呤‑透明质酸‑十八胺结合物。...

【技术特征摘要】
1.一种甲氨蝶呤前药的制备方法，其特征在于：包括：1)将透明质酸溶于第一有机溶剂中，20～40℃下加热至透明质酸溶解后冷却到室温，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应至少1h；将十八胺溶于第二有机溶剂后，加入至上述溶液中；所述十八胺与透明质酸单体的摩尔比为5:1～1:1；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与透明质酸单体的摩尔比、N-羟基琥珀酰亚胺与透明质酸单体的摩尔比均为8:1～1:1；然后在隔绝氧气的条件下，55～65℃搅拌至少5h，再在室温下搅拌22～26h；得到的混合溶液用体积比1:3～1:1的水-乙醇混合液透析45～50h，再用水透析45～50h，过滤，冷冻干燥，得到透明质酸-十八胺结合物；2)将甲氨蝶呤溶于第三有机溶剂中，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，搅拌反应至少30min；将步骤1)得到的透明质酸-十八胺结合物溶于第三有机溶剂后，加入至上述溶液中；所述甲氨蝶呤与透明质酸-十八胺结合物中的透明质酸单体的摩尔比为5:1～1:1；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与甲氨蝶呤的摩尔比、4-二甲氨基吡啶与甲氨蝶呤的摩尔比均为4:1～1:1；然后避光、室温反应45～50h，用水透析45～50h，冷冻干燥，得到甲氨蝶呤前药，为甲氨蝶呤-透明质酸-十八胺结合物。2.根据权利要求1所述的甲氨蝶呤前药的制备方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯振清，宋亮，李阳，王衍戈，张秀明，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35