一种叶酸修饰的果胶纳米粒子的双靶向递送方法技术

本发明专利技术公开了一种叶酸修饰的果胶纳米粒子的双靶向递送方法。所述的果胶纳米粒子是由果胶与八臂聚乙二醇共轭结合，果胶与叶酸通过酰胺键连接，八臂聚乙二醇与抗癌药物熊果酸通过酯键结合，得到叶酸‑(果胶‑多臂聚乙二醇)‑熊果酸前药，与抗癌药物羟基喜树碱以一定比例混合，通过自组装的方法制备核壳结构的双靶向纳米粒子。该方法制备的双靶向果胶纳米粒子生物相容性好，果胶可被结肠处的果胶酶降解，八臂聚乙二醇易为无毒载体，药物在体内运输过程无突释现象，体外释放实验显示出很好的pH值响应性。本文制备的纳米药物载药率高，包埋率可控，产率高，作为一种新型的药物载体，果胶具有很好的临床应用前景。

A dual targeting delivery method of folic acid modified pectin nanoparticles

The invention discloses a double targeted delivery method of folic acid modified pectin nanoparticles. The pectin nanoparticles are conjugated by the pectin with the eight arm polyethylene glycol, the pectin and the folic acid are connected through the amide bond. The eight arm polyethylene glycol and the anti-cancer ursolic acid are combined with the ester bond to obtain the folic acid prodrug of ursolic acid, which is mixed with the anticancer drug Hydroxycamptothecin in a certain proportion. Core shell dual target nanoparticles were prepared by self-assembly. The biocompatibility of the double target pectin nanoparticles prepared by this method is good, pectin can be degraded by pectinase in the colon, and the eight arm polyethylene glycol is easy to be nontoxic carrier. The drug is transported in the body without a sudden release phenomenon. The release experiment in vitro shows a good pH response. The nanomedicine has high drug loading rate, controllable embedding rate and high yield. As a new drug carrier, pectin has good clinical application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种叶酸修饰的果胶纳米粒子的双靶向递送方法
本专利技术涉及一种天然果胶作为药物载体制备新型抗癌药剂的方法，具体一种叶酸修饰的果胶纳米粒子的双靶向递送方法，属于高分子材料应用、先进纳米技术和生物制药领域。
技术介绍
果胶广泛存在于植物的果实、根、茎、叶中，是细胞壁的组成成分，构成相邻细胞中间层粘结物，使植物组织细胞紧紧黏结在一起。果胶是线形的多糖聚合物，主要由半乳糖醛酸组成，含有数百至约1000个脱水半乳糖醛酸残基，其相应的平均相对分子质量为50000～150000，主要应用于食品加工行业，如胶凝剂、乳化剂和增稠剂等。果胶良好的生物活性和生物相容性，成为药物载体的新宠儿，近几年研究人员发现果胶的半乳糖凝集素-3(Gal-3)配体具有识别干预肿瘤生长作用，且在胃肠道不能被消化，而结肠分泌的果胶酶可以降解果胶，实现了结肠靶向，同时研究发现果胶可靶向肝癌，诱导细胞凋亡，抑制细胞转移的作用，而现有关于果胶作为药物载体的报道很少，特别是基于靶向果胶载药的报道尚未有报道，因此，建立一种全新的果胶载药系统变得尤为重要，并为今后的研究提供一种新的途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种叶酸修饰的果胶纳米粒子的双靶向递送方法，解决疏水药物的溶解性问题，该方法的载体材料生物相容性好、无毒、可生物降解，将果胶设计成双靶向、双载药的果胶纳米粒子实现联合抗癌的功效。本专利技术的上述目的通过以下技术方案实现：果胶纳米粒子是由果胶与八臂聚乙二醇共轭结合，果胶与叶酸通过酰胺键连接，八臂聚乙二醇与抗癌药物熊果酸通过酯键结合，得到叶酸-(果胶-多臂聚乙二醇)-熊果酸前药，与抗癌药物羟基喜树碱以一定比例混合，通过自组装的方法制备核壳结构的双靶向纳米粒子。具体步骤如下：(1)将适量叶酸溶于二甲基亚砜中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)激活叶酸的末端羧基，反应30分钟后加入乙二胺和吡啶，搅拌均匀，避光反应24小时，得到氨基化叶酸(FA-NH2)，将反应液转移到透析膜内，磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)作为透析外液，透析过夜，每4小时更换一次透析外液，收集透析膜内溶液，冷冻干燥，得到黄色粉末；(2)取适量果胶溶于去离子水，搅拌均匀，加入EDC反应30分钟，激活果胶的羧基，再加入FA-NH2和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，避光反应24h，将反应液转移到透析膜内，磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)作为透析外液，透析过夜，每4小时更换一次透析外液，收集透析膜内溶液，冷冻干燥，得到叶酸-果胶(FA-Pectin)黄色粉末；(3)取适量八臂聚乙二醇溶于吡啶中，搅拌均匀，加入EDC反应30分钟，激活聚乙二醇的羧基，再加入抗癌药物熊果酸(UA)和催化剂DMAP，连续通氮气，35℃下反应48小时，取出混合液，加入三倍乙醚(v/v，相对于混合液体积)，搅拌均匀，有白色沉淀析出，4000转离心收集沉淀，并用乙醚多次洗涤离心，得到八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物粗品，将其转移到透析膜内，磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)作为透析外液，透析过夜，每4小时更换一次透析外液，收集透析膜内溶液，冷冻干燥，得到八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物(8armPEG-UA)白色粉末；(4)取八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物，EDC溶解在二甲基亚砜中，反应30分钟，加入叶酸-果胶和DMAP，连续通氮气，35℃避光反应48小时，取出混合液，加入三倍乙醚(v/v，相对于混合液体积)搅拌均匀，有黄色沉淀析出，4000转离心收集沉淀，并用乙醚多次洗涤离心，得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸(FA-Pectin-8armPEG-UA)粗品，将其转移到透析膜内，磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)作为透析外液，透析过夜，每4小时更换一次透析外液，收集透析膜内溶液，冷冻干燥，得到纯化的叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸黄色粉末；(5)二甲基亚砜溶解叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物，移液枪析出，逐滴滴入磷酸缓冲溶液中(PBS，pH＝7.4)，搅拌一段时间，得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸纳米粒子溶液，透析，每隔6小时更换透析外液，过夜，收集透析膜内液体，冷冻干燥，得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸纳米粒子黄色粉末；(6)取适量叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物和疏水药物羟基喜树碱溶于二甲基亚砜，搅拌均匀，逐滴滴入磷酸缓冲溶液中(PBS，pH＝7.4)，搅拌一段时间，得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱(FA-Pectin-8armPEG-UA/HCPT)纳米粒子溶液，透析，每隔6小时更换透析外液，过夜，收集透析膜内液体，冷冻干燥，得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱纳米粒子黄色粉末。作为优选，抗癌药物熊果酸可由其它抗癌药物代替，如紫杉醇、齐墩果酸、雷公藤甲素等。优选地，羟基喜树碱可由其它疏水性强的药物代替，也可以是具有光学性能的金纳米粒子，或磁靶向功能的四氧化三铁纳米粒子。优选地，羟基喜树碱可由其它疏水性强的药物代替，也可以是具有光学性能的金纳米粒子，或磁靶向功能的四氧化三铁纳米粒子。优选地，双靶向果胶纳米粒子粒径范围100纳米左右。本专利技术具有以下优点：(1)本专利技术选用果胶作为药物载体大大提高了药物的生物相容性，无突释现象，避免普通载体施药后存在的突释、生物相容性差、不能降解、在体内的堆积导致的毒副作用等。(2)本专利技术利用八臂聚乙二醇的两亲性特性，提高果胶与八臂聚乙二醇耦合作为共载体自组装形成的纳米粒子的稳定性和产率，提高纳米粒子的水溶性和分散性。(3)本专利技术的双靶向果胶纳米粒子是针对高发性结肠癌而研制的专一药物，有望临床应用。(4)本专利技术运载两种疏水抗癌药物，根据两种药物杀死癌细胞的作用机理的不通实现两种药物协同治疗癌症。说明书附图图1A合成氨基化叶酸的技术路线图，B合成八臂聚乙二醇-熊果酸的技术路线图，C合成叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸的技术路线图；图2自组装叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱纳米粒子的方案设计图；图3叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物的氢谱核磁图；图4叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱纳米粒子粒径分布图；图5叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱纳米粒子稳定性实验；图6叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱纳米粒子的溶血实验图；图7纳米粒子中熊果酸和羟基喜树碱的体外释放图；图8叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱纳米粒子的细胞毒性图；图9叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸纳米粒子的共聚焦成像图，A-羟基喜树碱，B-叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸纳米粒子，C-叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱纳米粒子；图10纳米粒子中熊果酸和羟基喜树碱在血液中的含量与时间的关系图；图11叶酸的浓度对结肠癌细胞活性的影响；图12施用纯药与纳米药物的小鼠肿瘤体积变化图；图13施药后小鼠的相对肿瘤体积图，小鼠存活率图，小鼠体重变化图，药物的超敏反应，血液中WBC细胞数。具体实施方式实施例一(1)将1.0g叶酸溶于二甲基亚砜中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)激活叶酸的末端羧基，反应30分钟后加入乙二胺和吡啶，搅拌均匀，避光反应24小时，得到氨基化叶酸(FA-NH2)，将反应液转移到透析本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种叶酸修饰的果胶纳米粒子的双靶向递送方法，其特征在于：所述的果胶纳米粒子是由果胶与八臂聚乙二醇共轭结合，果胶与叶酸通过酰胺键连接，八臂聚乙二醇与抗癌药物熊果酸通过酯键结合，得到叶酸‑(果胶‑多臂聚乙二醇)‑熊果酸前药，与抗癌药物羟基喜树碱以一定比例混合，通过自组装的方法制备核壳结构的双靶向纳米粒子。具体步骤如下：(1)将适量叶酸溶于二甲基亚砜中，加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)激活叶酸的末端羧基，反应30分钟后加入乙二胺和吡啶，搅拌均匀，避光反应24小时，得到氨基化叶酸(FA‑NH2)，将反应液转移到透析膜内，磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)作为透析外液，透析过夜，每4小时更换一次透析外液，收集透析膜内溶液，冷冻干燥，得到黄色粉末；(2)取适量果胶溶于去离子水，搅拌均匀，加入EDC反应30分钟，激活果胶的羧基，再加入FA‑NH2和4‑二甲氨基吡啶(DMAP)，避光反应24h，将反应液转移到透析膜内，磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)作为透析外液，透析过夜，每4小时更换一次透析外液，收集透析膜内溶液，冷冻干燥，得到叶酸‑果胶(FA‑Pectin)黄色粉末；(3)取适量八臂聚乙二醇溶于吡啶中，搅拌均匀，加入EDC反应30分钟，激活聚乙二醇的羧基，再加入抗癌药物熊果酸(UA)和催化剂DMAP，连续通氮气，35℃下反应48小时，取出混合液，加入三倍乙醚(v/v，相对于混合液体积)，搅拌均匀，有白色沉淀析出，4000转离心收集沉淀，并用乙醚多次洗涤离心，得到八臂聚乙二醇‑熊果酸耦合物粗品，将其转移到透析膜内，磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)作为透析外液，透析过夜，每4小时更换一次透析外液，收集透析膜内溶液，冷冻干燥，得到八臂聚乙二醇‑熊果酸耦合物(8armPEG‑UA)白色粉末；(4)取八臂聚乙二醇‑熊果酸耦合物，EDC溶解在二甲基亚砜中，反应30分钟，加入叶酸‑果胶和DMAP，连续通氮气，35℃避光反应48小时，取出混合液，加入三倍乙醚(v/v，相对于混合液体积)搅拌均匀，有黄色沉淀析出，4000转离心收集沉淀，并用乙醚多次洗涤离心，得到叶酸‑果胶‑八臂聚乙二醇‑熊果酸(FA‑Pectin‑8armPEG‑UA)粗品，将其转移到透析膜内，磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)作为透析外液，透析过夜，每4小时更换一次透析外液，收集透析膜内溶液，冷冻干燥，得到纯化的叶酸‑果胶‑八臂聚乙二醇‑熊果酸黄色粉末；(5)二甲基亚砜溶解叶酸‑果胶‑八臂聚乙二醇‑熊果酸耦合物，移液枪析出，逐滴滴入磷酸缓冲溶液中(PBS，pH＝7.4)，搅拌一段时间，得到叶酸‑果胶‑八臂聚乙二醇‑熊果酸纳米粒子溶液，透析，每隔6小时更换透析外液，过夜，收集透析膜内液体，冷冻干燥，得到叶酸‑果胶‑八臂聚乙二醇‑熊果酸纳米粒子黄色粉末；(6)取适量叶酸‑果胶‑八臂聚乙二醇‑熊果酸耦合物和疏水药物羟基喜树碱溶于二甲基亚砜，搅拌均匀，逐滴滴入磷酸缓冲溶液中(PBS，pH＝7.4)，搅拌一段时间，得到叶酸‑果胶‑八臂聚乙二醇‑熊果酸/羟基喜树碱(FA‑Pectin‑8armPEG‑UA/HCPT)纳米粒子溶液，透析，每隔6小时更换透析外液，过夜，收集透析膜内液体，冷冻干燥，得到叶酸‑果胶‑八臂聚乙二醇‑熊果酸/羟基喜树碱纳米粒子黄色粉末。...

【技术特征摘要】
1.一种叶酸修饰的果胶纳米粒子的双靶向递送方法，其特征在于：所述的果胶纳米粒子是由果胶与八臂聚乙二醇共轭结合，果胶与叶酸通过酰胺键连接，八臂聚乙二醇与抗癌药物熊果酸通过酯键结合，得到叶酸-(果胶-多臂聚乙二醇)-熊果酸前药，与抗癌药物羟基喜树碱以一定比例混合，通过自组装的方法制备核壳结构的双靶向纳米粒子。具体步骤如下：(1)将适量叶酸溶于二甲基亚砜中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)激活叶酸的末端羧基，反应30分钟后加入乙二胺和吡啶，搅拌均匀，避光反应24小时，得到氨基化叶酸(FA-NH2)，将反应液转移到透析膜内，磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)作为透析外液，透析过夜，每4小时更换一次透析外液，收集透析膜内溶液，冷冻干燥，得到黄色粉末；(2)取适量果胶溶于去离子水，搅拌均匀，加入EDC反应30分钟，激活果胶的羧基，再加入FA-NH2和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，避光反应24h，将反应液转移到透析膜内，磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)作为透析外液，透析过夜，每4小时更换一次透析外液，收集透析膜内溶液，冷冻干燥，得到叶酸-果胶(FA-Pectin)黄色粉末；(3)取适量八臂聚乙二醇溶于吡啶中，搅拌均匀，加入EDC反应30分钟，激活聚乙二醇的羧基，再加入抗癌药物熊果酸(UA)和催化剂DMAP，连续通氮气，35℃下反应48小时，取出混合液，加入三倍乙醚(v/v，相对于混合液体积)，搅拌均匀，有白色沉淀析出，4000转离心收集沉淀，并用乙醚多次洗涤离心，得到八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物粗品，将其转移到透析膜内，磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)作为透析外液，透析过夜，每4小时更换一次透析外液，收集透析膜内溶液，冷冻干燥，得到八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物(8armPEG-UA)白色粉末；(4)取八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物，EDC溶解在二甲基亚砜中，反应30分钟，加入叶酸-果胶和DMAP，连续通氮气，35℃避光反应48小时，取出混合液，加入三倍乙醚(v/v，相对于混合液...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷建都，刘彦雪，曹永丽，郑督，罗敏，孔天娇，杨子萱，肖萌，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11