一种酮基还原催化系统的构建及循环运行方法技术方案

本发明专利技术公开了一种酮基还原催化系统的构建及循环运行方法，本方法是靠以下技术途径实现的：用载体将催化酮基反应的还原酶和催化辅酶再生的葡萄糖脱氢酶进行共固定化处理，制成固定化多酶；以固定化多酶反应器，产品提取装置，300‑600Da纳滤装置组成酮基还原循环催化系统；固定化多酶反应器内，辅酶游离于反应液中，与固定化多酶共同作用，完成酮基还原反应和辅酶的循环再生。反应结束后，过滤回收固定化酶，滤液提取产品；提取母液加入氯化钙进行葡萄糖酸的脱除，之后通过300‑‑600Da纳滤装置对无机盐进行去除并同时完成辅酶的回收，实现酮基还原催化系统的循环运行。本方法成本低、效率高、操作简便、产物质量高、杂质少。

Construction and cyclic operation of a ketone reduction catalytic system

The invention discloses a method for the construction and circulation operation of a ketone reduction catalytic system. The method is realized by the following technical approach: a carrier is used to co immobilize the reductase of the catalytic ketone based reaction and the regenerated glucose dehydrogenase from the catalytic coenzyme, and the immobilized multi enzyme reactor is immobilized, and the product is immobilized. The extractor, 300 600Da nanofiltration unit, consists of a ketone based reduction cycle catalytic system; in the immobilized multi enzyme reactor, the coenzyme is free in the reaction liquid and acts together with the immobilized multi enzyme to complete the ketone reduction reaction and the recycling of coenzyme. After the reaction, the immobilized enzyme was recovered and the filtrate was extracted, and the extract was extracted with calcium chloride to remove the gluconic acid. Then the inorganic salt was removed by the 300 600Da nanofiltration device and the recovery of the coenzyme was completed at the same time, so as to realize the cycle operation of the ketone reduction catalytic system. The method has the advantages of low cost, high efficiency, simple operation, high quality and less impurities.

【技术实现步骤摘要】
一种酮基还原催化系统的构建及循环运行方法
本专利技术涉及生物制药领域，特别涉及一种酮基还原催化系统的构建及循环运行方法。
技术介绍
药物及药物中间体大多为大分子有机物质，这些物质许多具有旋光性，存在化学组成相同¸立体结构不同的对映体，因而被称为手性化合物。过去手性药物多数是以消旋体的形式出售，但已经发现许多手性药物的对映体具有不同的药理作用，如1961年欧洲出现了孕妇服用外消旋体的“反应停”药物¸产生多起畸胎的悲惨事件，因此目前许多含手性因素的药物或药物中间体，被要求以单一对映体的形式提供。化学合成具有旋光因素的有机物，一般为消旋化合物，为得到单一对映体，需要进行化学或酶法拆分，因此造成工序复杂¸收率偏低¸污染严重¸成本升高。生物酶可以将有潜手性的化合物或前体¸不对称催化合成单一对映体，从而得到具有光学活性的醇¸酸¸酯¸酮及胺衍生物，反应可以一步完成，不需要苛刻复杂的环境条件，因此酶催化合成手性药物或药物中间体日益成为药物研发的热点和趋势。手性醇¸手性酯和手性氨基酸是医药生产中比较重要的化合物，酶催化合成的方法一般是采用相应的酮基化合物进行加氢还原；反应中需要消耗大量的还原性辅酶Ⅰ或辅酶Ⅱ，由于辅酶价格昂贵，因此必须实现辅酶在反应中的循环再生，再生底物包括：葡萄糖¸甲酸及盐¸乳酸¸醇类等，利用葡萄糖脱氢酶进行辅酶再生，再生成本低¸再生效率高，是一种常用的辅酶再生方法。目前酶法酮基还原生产手性化合物，一般采用全细胞破碎法，工艺和设备较简单，不需添加辅酶，反应速度快，但酶是一次性使用，酶成本较高，后续提取产品困难。国内文献报道中，酮基还原酶催化反应的实验研究方法一般采用悬浮整细胞法，这种方法也不需要添加辅酶，反应副产物少；可以一次性使用，也可以在上批反应结束后，用离心或超滤法回收细胞，供下批反应使用，但这种方法酶活衰减较快，重复使用批次有限。作为对上述方法的改进，有的研究人员采用固定化细胞的方法，细胞与载体结合或被网状胶粒包埋，可以很容易地实现细胞的重复利用，理想条件下也可以达到上百批次的重复使用，但固定化细胞牢固度不够，一般需要在流化床或固定床中进行催化反应，反应底物需要穿透多层障碍进入细胞内，才能完成催化反应，而产物也必须穿透多层障碍才能从细胞内释放出来，因此固定化细胞法的催化效率比较低。为了提高催化效率及减轻提取工序的压力，液酶催化方法是一个值得采用的方法，上批反应结束后，还可以采用10000Da的超滤装置对酶进行回收，但游离状态酶的稳定性较差，使用批次有限，而且每重复使用一次，就必须添加一次昂贵的辅酶；对酶进行固定化处理，是对上述方法的改进，固定化多酶更是目前研究的热点，但这些方法都存在着重复利用时需要补加辅酶的问题。辅酶Ⅰ或辅酶Ⅱ是酮基还原酶与葡萄糖脱氢酶之间的氢质子及电子的传输载体，有的反应类型需要辅酶Ⅰ，有的反应类型需要辅酶Ⅱ，有的反应类型两种辅酶都可以使用，是酶催化酮基还原反应中必不可少的底物之一。在辅酶循环再生的前提下，辅酶用量虽少，但因价格昂贵，如需添加辅酶，则每批辅酶的成本往往高于大部分产品的成本，因此不解决辅酶重复回收利用的矛盾，就不可能实现酶催化酮基还原产品的高效¸低成本生产。辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的分子量在700左右，很容易考虑到的回收方案是用纳滤设备进行纳滤浓缩，可以对酮基还原酶和葡萄糖脱氢酶的液酶及辅酶一起回收；作为对上述方法的改进，可以将还原酶和脱氢酶进行固定化处理，反应结束后滤出固定化酶，提取产品，之后对提取母液进行纳滤浓缩。另一种能够考虑到的方案是对产品提取母液进行溶媒萃取，辅酶残留在萃取母液中，可以对萃取母液进行重复利用。上述方案虽然可以对辅酶进行回收，但没有考虑到产品提取母液中反应副产物的脱除，如大量的葡萄糖酸¸为控制PH稳定而产生的大量无机盐，这些反应副产物如不能得到有效脱除，则循环使用数次即可造成副产物的高浓度积累，进而导致酶的失活。葡萄糖酸分子量与辅酶的分子量存在一定的差别，另一种能够考虑到的方案是利用特定孔径的纳滤膜对葡萄糖酸和辅酶进行精确分离，但目前的纳滤技术不可能达到如此的精确度，因此这种方法不具有可操作性。综上所述，辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的回收利用是一件复杂和困难的技术，这也是到目前为止未发现有效回收辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ相关文献报道的根本原因。
技术实现思路
鉴于目前技术的不足，本专利技术提供了一种酮基还原催化系统的构建及循环运行方法，彻底解决了酶催化酮基还原生产中的技术瓶颈。本专利技术是通过以下技术方案实现的：对酮基还原酶菌株¸葡萄糖脱氢酶菌株或融合两种酶的工程菌株，进行扩大培养。离心培养液，收集菌体；用50mM磷酸盐缓冲液重悬菌体，≥50MPa压力均质破碎两次，离心，收集上清，得到酮基还原酶和葡萄糖脱氢酶混合液，层析柱分离纯化。纯化酶液中添加磷酸盐，调节成PH8.0¸1M磷酸盐浓度的酶液，将活化处理后的载体投入1M磷酸盐浓度的酶液中，固定20-60h；漂洗过滤后得固定化酶。反应体系为水相反应体系，分别加入产品底物和辅酶再生底物，加入固定化酶，最后加入辅酶进行反应；反应结束，用小于120um的滤网将固定化酶滤出，即可用于下批反应。滤液提取产品，提取母液中加入足量氯化钙溶液，过滤分别收集葡萄糖酸钙和二次滤液。用300-600Da的纳滤设备对二次滤液进行脱盐处理，中间加去离子水1--3次以增加脱除效果，最终浓缩液即为回收的辅酶。纳滤浓缩液用去离子水调整体积，投入上批回收的固定化酶，投入酮基化合物底物和葡萄糖，即可开始第二批反应。固定化酶和辅酶被反复回收和利用，即可实现手性醇¸手性酯或手性氨基酸的连续生产。本专利技术的有益效果在于：本专利技术对固定化多酶技术¸辅酶同步循环再生技术¸葡萄糖酸提取技术¸纳滤定向截留技术等进行了耦合和高效集成，彻底解决了酶催化酮基还原生产中的技术瓶颈，实现了酮基还原酶¸葡萄糖脱氢酶和辅酶的循环了利用¸生产催化效率高¸酶回收手段简便有效，生产成本大幅度降低。本专利技术利用葡萄糖酸的钙盐溶解度较低的性质，通过向产品提取母液中添加氯化钙溶液的方法，实现了葡萄糖酸的回收，回收的葡萄糖酸钙产品是一种优良的食品添加剂；取得了绿色环保¸变废为宝的效果。本专利技术采用沉淀技术去除葡萄糖酸¸采用纳滤技术脱除无机盐¸采用特定孔径的纳滤膜截留回收辅酶，实现了辅酶的有效回收并扫清了妨碍辅酶循环利用的一切技术障碍，为酶催化酮基还原技术的工业化应用奠定了坚实的基础。下面以具体实施例对本专利技术进行进一步说明（四）具体实施方式实施例1：（1）大肠杆菌酮基还原酶工程菌株¸大肠杆菌葡萄糖脱氢酶工程菌株分别扩大培养，各制备种子液100ml，分别接种于15L灭菌后的TB培养基中，控制PH7.0，培养温度37℃，发酵罐最高转速500转/分钟；溶氧反弹后开始补加60%甘油溶液，速率55ml/h；大约8h左右，OD600达到20，降温至30℃，压入无菌过滤后的IPTG溶液（含量1.2g）进行诱导，诱导6h后放罐。检测发酵液酶活，分别为16.5ug/ml和22.3ug/ml。（2）8000转/分钟离心收集菌体，分别得到菌体1246g和1356g；分别取酮基还原酶菌体600g¸葡萄糖脱氢酶菌体400g，用4L50mMPH8.0的磷酸盐缓冲液重悬¸分散均匀并混合；用均质机在50MPa压力下均质2次，均质液8000转/分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酮基还原催化系统的构建及循环运行方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）将酮基还原酶和葡萄糖脱氢酶进行共固定化处理，得到固定化多酶；（2）以固定化酶反应器¸产品提取装置¸300‑‑600Da纳滤装置组成酮基还原循环催化系统；（3）将固定化酶投入酶反应器中，加入辅酶Ⅰ或辅酶Ⅱ，加入酮基底物和葡萄糖进行催化反应；（4）反应结束后滤出固定化酶，滤液提取产品；（5）产品提取母液中加入氯化钙溶液，过滤，分别收集葡萄糖酸钙和滤液；（6）滤液用300‑‑600Da纳滤装置脱除无机盐及部分残留的葡萄糖酸，得辅酶浓缩液；（7）步骤（6）中的辅酶浓缩液用去离子水调整体积，加入步骤（4）中回收的固定化酶，加入酮基底物及葡萄糖，即可开始下一批反应；（8）依此重复步骤（7）¸步骤（4）¸步骤（5）¸步骤（6），实现酮基还原催化系统的连续循环运行。

【技术特征摘要】
1.一种酮基还原催化系统的构建及循环运行方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）将酮基还原酶和葡萄糖脱氢酶进行共固定化处理，得到固定化多酶；（2）以固定化酶反应器¸产品提取装置¸300--600Da纳滤装置组成酮基还原循环催化系统；（3）将固定化酶投入酶反应器中，加入辅酶Ⅰ或辅酶Ⅱ，加入酮基底物和葡萄糖进行催化反应；（4）反应结束后滤出固定化酶，滤液提取产品；（5）产品提取母液中加入氯化钙溶液，过滤，分别收集葡萄糖酸钙和滤液；（6）滤液用300--600Da纳滤装置脱除无机盐及部分残留的葡萄糖酸，得辅酶浓缩液；（7）步骤（6）中的辅酶浓缩液用去离子水调整体积，加入步骤（4）中回收的固定化酶，加入酮基底物及葡萄糖，即可开始下一批反应；（8）依此重复步骤（7）¸步骤（4）¸步骤（5）¸步骤（6），实现酮基还原催化系统的连续循环运行。2.根据权利要求1所述一种酮基还原催化系统的构建及循环运行方法，其特征在于：所述固定化酶反应器为带过滤和搅拌的批次反应罐。3.根据权利要求1所述一种酮基还原催化系统的构建及循环运行方法，其特征在于：所述提取装置包括：微孔疏水膜萃取器蒸馏釜吸附交换柱板...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭继先，于海勤，刘艳平，李辉，吴桂平，乔久生，
申请(专利权)人：山东睿鹰先锋制药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37