一种敲除酿酒酵母染色体的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开了一种敲除酿酒酵母染色体的方法。本发明专利技术利用Vika/vox技术切除酵母完整染色体，使染色体着丝粒通过位点特异性重组成环，从而实现整条染色体的敲除。本发明专利技术与现有通过减数分裂等方式实现整条染色体丢失的方法相比，更加简单、高效、快速地实现酿酒酵母染色体的切割：避免姐妹染色单体的交叉互换，获得染色体敲除后的酿酒酵母纯合二倍体菌株。

A method of knocking out the chromosomes of Saccharomyces cerevisiae

The invention relates to the field of biotechnology, and discloses a method for knocking out the chromosomes of Saccharomyces cerevisiae. The invention uses Vika/vox technique to excise the whole chromosome of yeast to restructure the chromosome centromere through the specificity of the loci, thus realizing the knockout of the whole chromosome. The present invention is more simple, efficient and faster to cut the chromosome of Saccharomyces cerevisiae compared with the existing method of realizing the whole chromosome loss through meiosis, which avoids the cross interchange of sister chromatids and obtains the homozygous two ploidy strain of Saccharomyces cerevisiae after chromosome knockout.

【技术实现步骤摘要】
一种敲除酿酒酵母染色体的方法
本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及一种敲除酿酒酵母染色体的方法。
技术介绍
生物基因组携带了决定生物基本性状的遗传信息，人工DNA合成技术和DNA大片段操作技术推动了基因组人工合成研究的进步。合成生物学的发展推动了通过人工设计合成来“写”基因组信息标志着“人造生命”的开始。基因组DNA长度过大，而且绝大多数真核生物具有多条染色体，且染色体长度都较大，涉及到染色体疾病或以染色体为单位的功能整合等都需要对整条染色体进行操作。如何实现整条染色体的敲除是一个值得探讨的问题。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，它用于制作面包和馒头等食品以及酿酒，同时还可以作为微生物发酵生产化学品的工程菌。酿酒酵母有单倍体和双倍体两种生活形态，由于双倍体酿酒酵母营养细胞大，生活能力强，工业上多用双倍体进行生产。为了能够进一步提高酿酒酵母的生产能力，需要对酵母的基因组进行改造，如果直接用二倍体改造，可能得到优良菌株是杂合的，遗传性状不稳定，而单倍体就成为一种很好地选择。通过将单倍体酵母改造为一种优良菌株，而后再通过交配重新形成优势的二倍体。但是，酿酒酵母在形成二倍体的过程本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种敲除酿酒酵母染色体的方法，其特征在于，包括：步骤1、人工合成待敲除的染色体上的着丝粒序列，并在两端添加vox序列，获得片段1；人工合成待敲除的染色体着丝粒上游同源臂和下游同源臂；同时，在所述着丝粒上游同源臂的3’端添加片段1的5’端同源序列以及在其5’端添加载体同源臂序列，获得片段2；在所述着丝粒下游同源臂5’端添加片段1的3’端同源序列以及在其3’端添加载体同源臂序列，获得片段3；步骤2、将所述片段1‑3分别形成完全互补的双链DNA，通过酶切和Gibson组装技术，与所述载体组装，获得质粒1；酶切质粒1获得片段2+片段1+片段3的完整片段4；步骤3、将所述完整片段4转化到待敲除染色体的单...

【技术特征摘要】
1.一种敲除酿酒酵母染色体的方法，其特征在于，包括：步骤1、人工合成待敲除的染色体上的着丝粒序列，并在两端添加vox序列，获得片段1；人工合成待敲除的染色体着丝粒上游同源臂和下游同源臂；同时，在所述着丝粒上游同源臂的3’端添加片段1的5’端同源序列以及在其5’端添加载体同源臂序列，获得片段2；在所述着丝粒下游同源臂5’端添加片段1的3’端同源序列以及在其3’端添加载体同源臂序列，获得片段3；步骤2、将所述片段1-3分别形成完全互补的双链DNA，通过酶切和Gibson组装技术，与所述载体组装，获得质粒1；酶切质粒1获得片段2+片段1+片段3的完整片段4；步骤3、将所述完整片段4转化到待敲除染色体的单倍体酿酒酵母菌株中，通过同源重组替换原有序列；然后与交配型不同得酿酒酵母菌株进行融合，构建二倍体酿酒酵母菌株；步骤4、向所述二倍体酿酒酵母菌株中转化含有vika基因的Vika质粒，通过Vika质粒上的诱导调控序列开启Vika蛋白表达，Vika蛋白诱导待敲除的染色体着丝两端的vox序列重组并丢失着丝粒，完成对整条染色体的敲除。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述载体同源臂为载体上酶切位点两端的同源臂。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述载体同源臂为pUC19质粒上酶切位点两端的同源臂。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述载体同源臂为pUC19质粒EcoRI酶切位点上游同源臂和HindIII酶切位点下游同源臂。5.根据权利要求1所述方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，吴毅，周嗣杰，马璐，刘瑞，刘明，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12