一种以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法技术

本发明专利技术提供一种以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，涉及生物技术领域。所述以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，以甘草渣为碳源，采用里氏木霉、尖孢镰刀菌、烟曲霉菌混合发酵，制备高活性的纤维素酶。将

A rapid preparation of high activity cellulase from low carbon source

The invention provides a method for rapidly preparing high activity cellulase from a cheap carbon source, and relates to the field of biotechnology. The method of fast preparation of highly active cellulase with low carbon source, using licorice residue as carbon source, was fermented with Trichoderma rimyensis, Fusarium oxysporum and Aspergillus fumigatus to prepare highly active cellulase. take

【技术实现步骤摘要】
一种以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法。
技术介绍
随着经济的发展，人类对石油、天然气、煤炭等不可再生化石能源的需求越来越大，由此产生了能源安全、石油消耗、全球变暖等诸多问题。这些问题促使世界各国加快了对安全、清洁、可再生的替代能源的研究。燃料乙醇是当前研究和应用都取得很大进展的一种清洁的可替代能源，但目前其生产主要依赖于淀粉和糖类原料，这两种原料利用涉及到与人畜争粮争地的问题，由此带来的粮食价格上涨问题已经显现。开发粮食以外的廉价原料对制取燃料乙醇技术意义重大。木质纤维素原料生产燃料乙醇的工艺流程主要包括预处理、纤维素酶水解以及发酵菌种和发酵工艺三步。纤维素酶是使纤维素降解生成葡萄糖的一组酶的总称，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶的三个组分经过协同作用，将大分子的纤维素降解为低分子量的寡糖、双糖或多糖。纤维素酶广泛的应用于食品加工业、酿造业、造纸工业、饲料添加剂、纺织工业、医药领域、植物细胞融合等方面。纤维素酶的产生菌包括细菌、真菌、酵母菌等，但目前主要用于纤维素酶生产的菌种主要为丝状真菌。丝状真菌产生的纤维素酶酶系较全，且其产生的酶多为胞外酶，便于后期的分离提取。目前传统工艺均采用单种菌株发酵产纤维素酶，酶活力较低，发酵生产时间过长。甘草(Glycyrrhiza)属豆科甘草属的一种多年生草本植物，在我国集中分布在新疆、内蒙古、宁夏和甘肃等地区，中心区在新疆塔里木河流域和内蒙古西鄂尔多斯高原。目前，对甘草其药理方面的研究较多，主要是提取甘草中有药效作用的部分，如甘草酸，甘草黄酮等。甘草渣是甘草在提取甘草浸膏、甘草酸等产品后的残渣，通常作为废弃物遗弃，会对环境造成一定的危害。甘草渣营养成分非常丰富，据分析，每千克干甘草渣含粗蛋白75克、粗纤维43克、粗脂肪8克，除此之外还含有许多甘草产生的生物活性成份。若能有效利用甘草渣，变废为宝，对于可持续发展有重大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种以低廉碳源—废弃甘草渣为原料，巧妙通过菌种的协同效应制备纤维素酶的方法，能够在较短的时间内获得较高的纤维素酶活力。本专利技术的目的采用如下技术方案实现。一种以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，以甘草渣为碳源，采用里氏木霉、尖孢镰刀菌、烟曲霉菌混合发酵，制备高活性的纤维素酶。在本专利技术中，所述里氏木霉为TrichodermareeseiATCC56764，所述尖孢镰刀菌为FusariumoxysporumBN，所述烟曲霉菌为AspergillusfumigatusHY。优选的技术方案中，所述TrichodermareeseiATCC56764、FusariumoxysporumBN和AspergillusfumigatusHY的比例为15-20:4-6:10-15。优选的技术方案中，将TrichodermareeseiATCC56764、FusariumoxysporumBN和AspergillusfumigatusHY分别划线接种至PDA培养基，培养2-5天后，用生理盐水洗下孢子，接种至发酵培养基进行混合发酵。在本专利技术中，所述发酵培养基含有如下成分：甘草渣8-11g/l，葡萄糖0.5-2.0g/l，(NH4)2SO42-5g/l，KH2PO41-4g/l，MgSO4·7H2O0.4-0.6g/l，大豆粉7-10g/l，pH4.0-5.0。优选的技术方案中，发酵温度为25-35℃，发酵时间90-100h。优选的技术方案中，将发酵液离心，取上清液作为纤维素酶液。申请人通过大量筛选实验，发现将TrichodermareeseiATCC56764、FusariumoxysporumBN和AspergillusfumigatusHY混合发酵，不仅能够显著缩短发酵时间，而且能够显著提高纤维素酶活力。三种菌株混合发酵后，产生的纤维素酶活性大于各菌株单独发酵产生的纤维素酶活性之和，即三种菌株混合发酵产生了协同增效作用。另外，采用本专利技术方法制备高活性纤维素酶，由于碳源是甘草渣，原料易得、成本低廉，减少了甘草渣焚烧带来的环境污染，且发酵过程对环境无污染，具有广阔的市场前景。采用本专利技术方法制备的纤维素酶，最适反应温度为60度，而且在该温度下酶活力稳定，应用于水解秸秆，耗时短，葡萄糖含量高。附图说明图1显示了反应pH对纤维素酶活力的影响。图2显示了反应温度对纤维素酶活力的影响。具体实施方式实施例一采用TrichodermareeseiATCC56764、FusariumoxysporumBN和AspergillusfumigatusHY发酵制备纤维素酶。1.菌株来源TrichodermareeseiATCC56764购自美国模式培养物保藏所。FusariumoxysporumBN的GenBankaccessionNo.KM979515)、AspergillusfumigatusHY的GenBankAccessionNo.KF813024)。2.种子液的获得种子液的获得：将TrichodermareeseiATCC56764、FusariumoxysporumBN、AspergillusfumigatusHY分别接种于PDA培养基(每升培养基组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然)上，30℃培养3d。用生理盐水分别洗下各菌株的孢子，将各菌株的孢子悬液混合得到了种子液。种子液中，所有菌株的集落形成单位数目为1×107CFU/ml，其中TrichodermareeseiATCC56764、FusariumoxysporumBN、AspergillusfumigatusHY集落形成单位数目之比为20:5:15。3.制备纤维素酶发酵培养基含有如下成分：甘草渣(含水率为5％，粉碎至200目-300目)10g/l，葡萄糖1g/l,(NH4)2SO44g/l，KH2PO42g/l，MgSO4·7H2O0.5g/l，大豆粉8g/l，pH4.5。采用本专利技术方法制备纤维素酶，包括如下步骤：将1ml种子液接种至100ml发酵培养基中，在30℃、180rpm条件下震荡培养6天，每隔24小时，取发酵液，离心取上清液作为纤维素酶液。检测纤维素酶液的活力(滤纸酶活力)。滤纸酶活力(FPA)按照国际理论和应用化学协会推荐的标准方法测定(GhoseTK.Measurementofcellulaseactivities.Pure&Appl.chem.,1987,59(2):257～268),以国际单位(IU)表示。一个国际滤纸酶活力单位(IU)等于酶水解反应中每分钟由滤纸(WhatmanNo.1)生成1μmol葡萄糖的酶量。对比试验1：将1ml的TrichodermareeseiATCC56764孢子悬液(集落形成单位数目为5×106CFU/ml)接种至100ml发酵培养基，在30℃、180rpm条件下震荡培养6天，每隔24小时，取发酵液，离心取上清液检测纤维素酶活力(滤纸酶活力)。对比试验2：将1ml的FusariumoxysporumBN孢子悬液(集落形成单位数目为1.25×106CFU/ml)接种至100ml发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，其特征在于以甘草渣为碳源，采用里氏木霉、尖孢镰刀菌、烟曲霉菌混合发酵，制备高活性的纤维素酶。

【技术特征摘要】
1.一种以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，其特征在于以甘草渣为碳源，采用里氏木霉、尖孢镰刀菌、烟曲霉菌混合发酵，制备高活性的纤维素酶。2.根据权利要求1所述以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，其特征在于所述里氏木霉为TrichodermareeseiATCC56764，所述尖孢镰刀菌为FusariumoxysporumBN，所述烟曲霉菌为AspergillusfumigatusHY。3.根据权利要求2所述以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，其特征在于所述TrichodermareeseiATCC56764、FusariumoxysporumBN和AspergillusfumigatusHY的比例为15-20:4-6:10-15。4.根据权利要求1-3之一所述以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，其特征在于将Trich...

【专利技术属性】
技术研发人员：许家兴，贺爱永，夏军，吴真，胡磊，徐宁，
申请(专利权)人：淮阴师范学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32