模拟急性肺损伤时肺上皮细胞和毛细血管内皮细胞屏障功能的体外模型的建立方法技术

本发明专利技术公开了一种模拟急性肺损伤时肺上皮细胞和毛细血管内皮细胞屏障功能的体外模型的建立方法，所述方法包括以下步骤：步骤(1)应用Transwell共培养体系将内毒素感染后的小鼠C3H/10T1/2微血管内皮细胞株接种于小室的下层培养；将小鼠源性TC‑1肺上皮细胞株接种于小室的上层，共培养一段时间后收集细胞培养上清液；步骤(2)检测细胞培养上清液中的肺上皮细胞/内皮细胞屏障合成与表达炎性因子和炎性细胞浸润相关蛋白的情况，建立成一个适于内毒素性急性肺损伤研究的肺上皮细胞/微血管内皮细胞共培养模型。本发明专利技术建立的模型接近体内内毒素性急性肺损伤时的细胞屏障功能，可为临床上急性肺损伤研究提供可靠的模型基础。

Establishment of an in vitro model for simulating the barrier function of pulmonary epithelial cells and capillary endothelial cells in acute lung injury

The present invention discloses a method for establishing an in vitro model for simulating the barrier function of pulmonary epithelial cells and capillary endothelial cells in acute lung injury. The method includes the following steps: step (1) the Transwell co culture system is used to inoculate the mouse C3H/10T1/2 microvascular endothelial cells after endotoxin infection in the lower layer of the chamber. Breeding; inoculating mouse derived TC 1 lung epithelial cell line into the upper layer of the compartment and collecting cell culture supernatant after a period of time. Step (2) detection of the conditions of the lung epithelial cell / endothelial cell barrier in the cell culture supernatant to synthesize and express inflammatory factors and inflammatory cell infiltration related proteins. A model of co culture of lung epithelial / microvascular endothelial cells was established in the study of toxic acute lung injury. The model established by this invention is close to the cell barrier function in the internal toxic acute lung injury in the body, which can provide a reliable model basis for the study of acute lung injury in clinical.

【技术实现步骤摘要】
模拟急性肺损伤时肺上皮细胞和毛细血管内皮细胞屏障功能的体外模型的建立方法
本专利技术涉及细胞模型建立
，尤其涉及一种模拟急性肺损伤时肺上皮细胞和毛细血管内皮细胞屏障功能的体外模型的建立方法。
技术介绍
内毒素性急性肺损伤(acutelunginjury,ALI)临床上常见的危重病症。ALI的发病机制多种多样，由于内毒素脂多糖(LPS)引起的占绝大多数，可分为LPS直接损伤和LPS间接损伤(促炎/抗炎反应失衡，促凝/抗凝反应的失衡，氧化应激，胞凋亡紊乱紊乱等)，肺泡一毛细血管屏障Ⅲ，导致毛细血管通透性增加、中性粒细胞浸润和炎性介质的释放失控，并在损伤部位聚集诱发一系列的症状。ALI是感染、创伤等导致机体炎性反应失控的结果，炎性因子在ALI的病程发生和发展中发挥着重要的作用。白介素(interleukin,IL-1)与ALI时炎性细胞的浸润与活化密切相关，IL-6既是炎性因子，同时亦有抗炎作用。但动物实验显示，在ALI时肺组织内高水平的IL6主要发挥炎性因子作用，它可以抑制肺组织内浸润中性粒细胞的凋亡，增强肺内的炎性反应。虽然炎性因子在AL1的发生和发展中发挥着重要的作用，但是ALI的病理机制中还存在着其它影响因素——肺上皮细胞和毛细血管内皮细胞屏障。在病理状态下，肺上皮细胞具有阻止富蛋白液体漏入肺泡腔的作用，而且它还有助于肺水肿的回吸收。但是ALI和ARDS时肺上皮细胞大量凋亡，此时上皮细胞/内皮屏障破坏且功能受损。动物实验证实，ALI时通过抑制肺上皮细胞凋亡可以降低肺内炎性因子水平、减轻肺损伤、降低实验动物死亡率。这提示，肺上皮/内皮细胞屏障的功能在ALI病程中具有重要的作用。ALI时肺组织内炎性因子水平高于血浆，肺组织内炎性因子主要来源于肺内浸润的炎性细胞，而肺上皮细胞亦与肺内的炎性反应相关。ALI时肺上皮细胞不仅参与分泌炎性因子(如TNF-α、IL-1和IL6等)，它还能增加细胞相关粘附分子-1(intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1)的表达并促进中性粒细胞肺内浸润。以上实验资料提示，肺上皮细胞在ALI病程中参与了肺内的炎性反应。内毒素ALI时肺上皮/内皮细胞屏障的体外实验需要相应的细胞共培养模型。LPS是炎症爆发的主要激活物，建立内毒素所致ALI时肺上皮/内皮细胞屏障体外模型对于临床治疗药物的研究和开发具有重要的意义。周长喜等曾经应用Transwell共培养体系制作了人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549细胞株与人肺微血管内皮细胞株HPMECs的共培养模型，并将它用于研究鞭毛蛋白刺激对肺上皮细胞表达TNF-α的影响，但是周长喜的研究未涉及临床上最常见的内毒素ALI时肺上皮/内皮细胞的屏障功能，其建立的共培养模型建立时间为15天，主要关注的是肺损伤较长时间后鞭毛蛋白感染是否诱发肺血管内皮细胞炎症且能否向肺泡上皮细胞传递级联放大。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种模拟急性肺损伤时肺上皮细胞和毛细血管内皮细胞屏障功能的体外模型的建立方法，所述细胞模型可作为研究内毒素所致的ALI中上皮/内皮细胞屏障功能，肺通透性等病理生理学变化，微血管组织修复机制的模型基础。本专利技术的技术方案如下：一种模拟急性肺损伤时肺上皮细胞和毛细血管内皮细胞屏障功能的体外模型的建立方法，所述方法包括以下步骤：步骤(1)应用Transwell共培养体系将内毒素(LPS)感染后的小鼠C3H/10T1/2微血管内皮细胞株接种于Transwell小室的下层培养；小鼠源性TC-1肺上皮细胞株接种于Transwell小室的上层，培养一段时间后收集上层细胞和下层细胞培养上清液；步骤(2)内毒素感染小鼠肺微血管内皮细胞后，再与上皮细胞共培养，检测细胞培养上清液中的肺上皮细胞/内皮细胞屏障合成与表达炎性因子和炎性细胞浸润相关蛋白的情况，在上皮细胞和肺微血管内皮细胞上清液中都检测到IL-6和ICAM-1蛋白表达上调，表明建立成一个适于ALI研究的肺上皮细胞/微血管内皮细胞共培养模型。进一步地，所述微血管内皮细胞的培养基为添加了10-20％(w/w)胎牛血清(FBS)，90-95U/mL肝素，2-4mmol/mLL-谷氨酰胺，10-15ng/mL内皮细胞生长因子添加剂，1-1.5％(w/w)青霉素钠盐和硫酸链霉素的H-DMEM培养基。进一步地，所述肺上皮细胞株的培养基为添加了10-20％(w/w)FBS、1-1.5％(w/w)青霉素钠盐和1-1.5％硫酸链霉素的1640培养基。进一步地，所述微血管内皮细胞株培养4～6h后再将肺上皮细胞株接种于Transwell小室的上层。进一步地，所述微血管内皮细胞株的接种浓度为3.5×104/cm2～4.5×104/cm2，接种体积为1～2mL；所述肺上皮细胞株的接种浓度为1.5×104/cm2～2.5×104/cm2，接种体积为0.8～1.5mL。进一步地，所述内毒素(LPS)感染小鼠C3H/10T1/2微血管内皮细胞株的浓度为0.8～1.2μg/mL。本专利技术第二方面，还提供通过所述的建立方法建立的模拟急性肺损伤时肺上皮细胞和毛细血管内皮细胞屏障功能的体外模型。由于在体内情况下急性肺损伤发生后48小时内会分泌大量炎性因子，本专利技术旨在复制一种最接近体内内毒素急性肺损伤情况的模型，本专利技术关注的时间点是损伤后48小时内。ALI时，肺上皮/内皮细胞屏障可以分泌炎性因子、表达ICAM-1促进炎性细胞附着浸润，同时也表达细胞间紧密连接蛋白(如occludin)以阻挡炎性细胞浸润。因此适于ALI体外实验研究的肺上皮/内皮细胞共培养模型不仅应具有合成与分泌炎性因子的功能，还应该能表达细胞间紧密连接蛋白，并呈现屏障作用。本专利技术在Transwell共培养体系内制作小鼠LA-4肺上皮细胞与小鼠C3H/10T1/2微血管内皮细胞的共培养模型，通过调整细胞培养条件以建立一个在内毒素刺激下能表达炎性因子(IL6)和炎性细胞浸润相关蛋白(ICAM-1)的肺上皮/内皮细胞共培养模型，此模型能够模拟体内LPS急性肺损伤时肺上皮/内皮细胞屏障的功能。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术建立的这一模型接近体内内毒素性急性肺损伤时的细胞屏障功能，可为临床上急性肺损伤研究提供一种可靠的模型基础，本专利技术通过调整细胞培养条件建立一个在内毒素刺激下能表达炎性因子(IL6)和炎性细胞浸润相关蛋白(ICAM-1)的肺上皮/内皮细胞共培养模型，本模型具有合成与分泌炎性因子的功能，还应该能表达细胞间紧密连接蛋白，并呈现屏障作用。附图说明图1为IL-6蛋白表达结果图；图2为ICAM-1蛋白表达结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步详细说明，但本专利技术并不局限于以下技术方案。实施例1本实施例在Transwell共培养体系内制作小鼠TC-1肺上皮细胞与小鼠C3H/10T1/2微血管内皮细胞的共培养模型，通过调节细胞培养环境，使得此肺上皮细胞/微血管内皮细胞共培养模型在内毒素刺激下能表达炎性因子(IL6)和炎性细胞浸润相关蛋白(ICAM-1)。制作肺上皮细胞/微血管内皮细胞共培养模型过程如下：应用Transwell共培养体系将1ug/mLLPS感染的小鼠C3H/10T1/2微血管内皮细胞株以4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种模拟急性肺损伤时肺上皮细胞和毛细血管内皮细胞屏障功能的体外模型的建立方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤(1)应用Transwell共培养体系将内毒素感染后的小鼠C3H/10T1/2微血管内皮细胞株接种于Transwell小室的下层培养；小鼠源性TC‑1肺上皮细胞株接种于Transwell小室的上层，培养一段时间后收集上层细胞和下层细胞培养上清液；步骤(2)内毒素感染小鼠肺微血管内皮细胞后，再与上皮细胞共培养，检测细胞培养上清液中的肺上皮细胞/内皮细胞屏障合成与表达炎性因子和炎性细胞浸润相关蛋白的情况，在上皮细胞和肺微血管内皮细胞上清液中都检测到IL‑6和ICAM‑1蛋白表达上调，表明建立成一个适于ALI研究的肺上皮细胞/微血管内皮细胞共培养模型。

【技术特征摘要】
1.一种模拟急性肺损伤时肺上皮细胞和毛细血管内皮细胞屏障功能的体外模型的建立方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤(1)应用Transwell共培养体系将内毒素感染后的小鼠C3H/10T1/2微血管内皮细胞株接种于Transwell小室的下层培养；小鼠源性TC-1肺上皮细胞株接种于Transwell小室的上层，培养一段时间后收集上层细胞和下层细胞培养上清液；步骤(2)内毒素感染小鼠肺微血管内皮细胞后，再与上皮细胞共培养，检测细胞培养上清液中的肺上皮细胞/内皮细胞屏障合成与表达炎性因子和炎性细胞浸润相关蛋白的情况，在上皮细胞和肺微血管内皮细胞上清液中都检测到IL-6和ICAM-1蛋白表达上调，表明建立成一个适于ALI研究的肺上皮细胞/微血管内皮细胞共培养模型。2.如权利要求1所述的体外模型的建立方法，其特征在于，所述微血管内皮细胞的培养基为添加了10-20％(w/w)胎牛血清(FBS)，90-95U/mL肝素，2-4mmol/mLL-谷氨酰胺，10-15ng/mL内皮细胞生长因子添加剂，1...

【专利技术属性】
技术研发人员：马微，李力燕，郭建辉，杨金伟，代云飞，王先斌，刘矿嫔，张同，王嘉蔚，
申请(专利权)人：昆明医科大学，
类型：发明
国别省市：云南,53