一种铜的耐高盐核酸传感器及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种铜的耐高盐核酸传感器及其应用。所述传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，所述分子识别元件包括铜离子脱氧核酶；所述铜离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系，所述等温扩增体系包括扩增模板；所述信号转换元件包括氯高铁血红素和显色剂。本发明专利技术的传感器，特异性识别铜离子，通过等温指数放大反应进行信号一级的扩大和转化；在氯高铁血红素诱导下形成具有活性的G‑四链体结构，催化显色剂显色，从而产生二级放大与转化，转化成可视化的信号，可以进行高盐环境中的定性和定量的检测。

A copper resistant high salt nucleic acid sensor and its application

The invention discloses a high salt resistant nucleic acid sensor for copper and its application. The sensor includes a molecular recognition element, a signal amplification element, and a signal conversion element, which consists of a copper ion deoxyrizase; the copper ion deoxy ribozyme is composed of a substrate chain and an enzyme chain; the signal amplification element includes an isothermal amplification system, and the isothermal amplification system includes an amplification template; The signal conversion elements include hemin and chromogenic agent. The sensor of the invention identifies the copper ion specifically, amplifies and transforms the first level of the signal through the isothermal exponential amplification reaction, forms the active G four chain body structure under the induction of chloro HMV, catalyzes the color rendering of the chromogenic agent, thus produces two stages of amplification and transformation, and can be transformed into a visual signal. Qualitative and quantitative detection in a salt environment.

【技术实现步骤摘要】
一种铜的耐高盐核酸传感器及其应用
本专利技术属于重金属检测
，具体涉及一种铜的耐高盐核酸传感器及其应用。。
技术介绍
铜是一种过渡元素，纯铜是柔软的金属，延展性好，导热性和导电性高，因此在电缆和电气、电子元件是最常用的材料，也可用作建筑材料，可以组成众多种合金。铜(Cu)及其化合物在环境中所造成的污染主要由于铜锌矿的开采和冶炼、金属加工、机械制造、钢铁生产等产生，其中，冶炼排放的烟尘是大气铜污染的主要来源。对于生物而言，不论是动物或植物，铜都是所必需的微量元素。正常人体内铜的量为100-200毫克，约50％-70％存在于肌肉和骨骼，20％存在于肝脏，5％-10％分布于血液。在人体中铜离子主要以作为许多酶和蛋白(如超氧化物歧化酶、细胞色素氧化酶、多巴胺β-羟化酶、酪氨酸酶、铜蓝蛋白和朊蛋白等)的催化辅助因子或结构组成，广泛参与体内许多重要的新陈代谢过程，影响着人体血液的生成、结缔组织的形成，中枢神经系统，胆固醇和葡萄糖的代谢，心脏功能和免疫系统等，人体仅仅需要微量的铜就可以维持正常的生命活动。但是，铜缺乏或铜过量都会对健康产生不利的影响。铜缺乏一般伴随着其他营养元素的缺乏或者其生物拮抗物质的摄取过量，影响细胞内许多酶的正常功能，进而影响细胞的新陈代谢过程。铜过量通常是由于遗传性疾病或者由于环境重金属污染，误食了大量含铜的食物或吸入了含铜量高的气体所造成。在食物中铜主要以二价形式和一些有机物，如蛋白质与氨基酸等形成复合物。这些复合物经过胃时，胃蛋白酶分解蛋白质，胃酸会促进铜离子的溶解，通过小肠时在十二指肠中吸收，最后再运送到肝脏。肝脏是储存铜离子的重要场所，也是铜排入胆汁的重要器官，铜过量会影响肝肾的正常代谢，造成胃肠道功能紊乱和溶血性贫血等；过多的铜离子若在脑、心脏等处沉淀，会造成神经退行性疾病和全身性的症状，包括威尔逊氏综合症和阿尔茨海默氏症。鉴于铜离子在生物体内的重要作用，以及其缺乏或过量会对生态系统、食品安全和人体健康方面会产生巨大的危害，因此，铜离子的检测就显得尤为重要。常见的铜离子的检测方法主要有原子光谱法，包括原子吸收光谱、电感耦合等离子体发射光谱法和焚光光谱法，可见分光光度法，流动注射化学发光法和微分电位溶出法等，但是这些检测方法都需要昂贵的仪器和经过专业培训的操作人员，样品前处理也比较繁琐，不具有普遍适用性。因此，研究出简单快速、成本低廉、可准确定量的检测方法十分必要。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是，为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术提供一种能够实现可视化检测、简便快速、高灵敏度和高特异性、耐高盐的铜离子检测的功能核酸显色传感器。本专利技术基于的基本原理为：铜离子脱氧核酶由底物链与酶链两条寡核苷酸链组成、形成特定的二级结构；痕量铜离子能够特异性识别铜离子脱氧核酶、结合核酶的酶链，并激活核酶、切割核酶的底物链，产生切割产物。在切割产物存在的时候，促发EXPAR发生、放大信号，并生成大量富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列，该序列在氯高铁血红素诱导下形成G-四链体结构、发挥类辣根过氧化物酶(HRP)活性，催化过氧化氢与四甲基联苯胺显绿色，硫酸终止反应后显黄色。可以通过手持式光谱检测仪进行检测与定量。为了实现本专利技术的目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供的一种铜的耐高盐核酸传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，所述分子识别元件包括铜离子脱氧核酶；所述铜离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系，所述等温扩增体系包括扩增模板；所述信号转换元件包括氯高铁血红素和显色剂；所述脱氧核酶底物链、酶链和扩增模板序列如下表：上述传感器中，所述等温扩增体系包括A体系和B体系；所述A体系包括：扩增模板、dNTPs、脱氧核酶切割产物；所述B体系包括：BstDNA聚合酶及其缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液。所述BstDNA聚合酶缓冲溶液为：20mMTris-HCl,10mM(NH4)2SO4,50mMKCl,2mMMgSO4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，pH8.8；所述Nt.BstNBI切刻内切酶缓冲溶液为100mMNaCl,50mMTris-HCl,10mMMgCl2,300μg/ml海藻糖，pH7.9。上述传感器中，所述信号转化元件还包括终止剂，优选的，所述终止剂为硫酸(2mol/L)；所述显色剂为TMB显色剂。上述传感器在检测铜离子中的应用。本专利技术还提供了一种检测铜离子的方法，包括步骤如下：制备铜离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度(OD值)关系的标准曲线；按上述制备标准曲线的过程进行待测样品的检测，得到待测样品的G-四链体功能核酸显色光密度值，通过上述标准曲线计算铜离子的浓度；其中铜离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线的步骤包括：(1)制备铜离子脱氧核酶切割产物：将铜离子脱氧核酶底物链与酶链混合、加热、降温得到铜离子脱氧核酶，然后加入不同浓度的铜离子溶液反应，终止反应后，得到不同浓度的铜离子脱氧核酶切割产物溶液；(2)目标产物的等温扩增：等温扩增体系由A体系、B体系组成；所述A体系包括扩增模板、dNTPs、铜离子脱氧核酶切割产物；所述B体系包括BstDNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；所述拖延核酶底物链、酶链和扩增模板序列如下表：其中扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列；将所述不同浓度的铜离子脱氧核酶切割产物溶液与其他A体系的组成物质混合，制备不同的铜离子浓度的A体系，然后分别与B体系混合，进行等温扩增反应，得到一系列浓度的扩增产物；(2)G-四链体结构显色物制备将氯高铁血红素与上述一系列扩增产物分别进行反应，然后加入显色液后进行OD值检测，得到OD值随铜离子浓度变化的标准曲线。上述方法中，所述铜离子脱氧核酶的制备方法包括：将铜离子脱氧核酶底物链与铜离子脱氧核酶酶链用缓冲液稀释，95℃加热15min，然后缓慢降温至25℃。上述方法中，所述等温扩增反应的步骤为：加入铜离子溶液的A体系在进行等温扩增反应前95℃孵育5min后，A体系和B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min；95℃保持10min，以终止反应。上述方法中，氯高铁血红素与扩增产物反应的方法为：将氯高铁血红素与扩增产物混匀后37℃反应30min，加入TMB显色剂，混匀，37℃反应10min，H2SO4终止反应。本专利技术同时也提供了一种检测铜离子的试剂盒，包括：铜离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显示体系；所述铜离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链和铜离子标准溶液；所述等温扩增体系包括A体系、B体系，所述A体系包括扩增模板和dNTPs；所述B体系包括BstDNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；所述拖延核酶底物链、酶链和扩增模板序列如下表：其中扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列；所述显色体系包括：氯高铁血红素和显色剂，所述显色剂为TMB显色剂。上述试剂盒中，优选的，所述A体系组成：1μM扩增模板母液：6μL，终浓度0.2μM；2.5mMdNTPs母液:3μL；所述B体系组成：8U/μLB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种铜的耐高盐核酸传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，其特征在于，所述分子识别元件包括铜离子脱氧核酶；所述铜离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系，所述等温扩增体系包括扩增模板；所述信号转换元件包括氯高铁血红素和显色剂；所述脱氧核酶底物链、酶链和扩增模板序列如下表：

【技术特征摘要】
1.一种铜的耐高盐核酸传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，其特征在于，所述分子识别元件包括铜离子脱氧核酶；所述铜离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系，所述等温扩增体系包括扩增模板；所述信号转换元件包括氯高铁血红素和显色剂；所述脱氧核酶底物链、酶链和扩增模板序列如下表：2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述等温扩增体系包括A体系和B体系；所述A体系包括：扩增模板、dNTPs、脱氧核酶切割产物；所述B体系包括：BstDNA聚合酶及其缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液。3.根据权利要求1或2所述的传感器，其特征在于，所述信号转化元件还包括终止剂，优选的，所述终止剂为硫酸；所述显色剂为TMB显色剂。4.权利要求1-3任一项所述传感器在检测铜离子中的应用。5.一种检测铜离子的方法，其特征在于，包括步骤如下：制备铜离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线；按上述制备标准曲线的过程进行待测样品的检测，得到待测样品的G-四链体功能核酸显色光密度值，通过上述标准曲线计算铜离子的浓度；其中铜离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线的步骤包括：(1)制备铜离子脱氧核酶切割产物：将铜离子脱氧核酶底物链与酶链混合、加热、降温得到铜离子脱氧核酶，然后加入不同浓度的铜离子溶液反应，终止反应后，得到不同浓度的铜离子脱氧核酶切割产物溶液；(2)目标产物的等温扩增：等温扩增体系由A体系、B体系组成；所述A体系包括扩增模板、dNTPs、铜离子脱氧核酶切割产物；所述B体系包括BstDNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；所述脱氧核酶底物链、酶链和扩增模板序列如下表：其中扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切...

【专利技术属性】
技术研发人员：许文涛，罗云波，黄昆仑，田晶晶，杜再慧，肖冰，董凯，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11