一种稻瘟病的生物防治方法技术

一种稻瘟病的生物防治方法，涉及水稻病虫害的生物防治技术领域，本发明专利技术的制备方法包括：制备梯度稀释液、制备NA固体培养基、芽胞杆菌分离、制备LB液体培养液、制备粗提蛋白质液、水稻定殖。本发明专利技术分离得芽胞杆菌能够分泌抗菌物质来抑制病原菌生长，并诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，供试菌株对稻瘟病菌分生抱子的萌发、芽管的延长和附着胞的形成具有显著的抑制作用，本发明专利技术的菌株活性物质对稻瘟病菌有较强的抑制作用，对稻瘟病菌菌丝生长抑制率达到80％以上。

【技术实现步骤摘要】
一种稻瘟病的生物防治方法
本专利技术涉及水稻病虫害的生物防治
，具体涉及一种稻瘟病的生物防治方法。
技术介绍
水稻是中国第一大粮食作物，其产量占中国粮食产量的40％左右。而水稻3大病害包括稻瘟病、白叶枯病及稻纹枯病，其中稻瘟病是水稻生产上威胁最大的病害之一，由真菌梨抱霉菌感染引起，可发生在水稻整个发育时期。由于该病流行速度快，在适宜的环境条件下，短时间内即可造成大流行，给水稻生产带来巨大损失。目前，农业上主要采取抗病育种和化学药剂来逐渐控制稻瘟病。但由于稻瘟病菌的遗传背景复杂，易变异，抗病品种难跟上致病菌生理小种的变异速度，常常导致一个新的具有抗病性的水稻品种在种植几年后丧失抗性。而化学防治，不仅会污染环境，降低水稻质量，破坏生态，还导致病菌的耐药性不断增加从而降低防效。因此，探索新的方法来控制和解决稻瘟病越来越受关注。因此寻找稻瘟病有效的、低毒性、不受病原菌抗性影响的生物防治途径对于粮食安全至关重要。
技术实现思路
根据现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种稻瘟病的生物防治方法，具有低毒性、不受病原菌抗性影响，且对稻瘟病菌的抑制率高等优点。本专利技术采用以下技术方案：一种稻瘟病的生物防治方法，包括以下步骤：步骤一：选取健康水稻叶片，剪成5cm的叶段，放入装有质量浓度75％乙醇的三角瓶中振荡洗涤2次后倒掉乙醇，加入无菌水浸泡30min后梯度稀释，得梯度稀释液；步骤二：制备NA固体培养基，采用蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、葡萄糖2.5g，加蒸馏水溶解，定容至1L，PH调至7±0.1，分装后121℃灭菌20min；步骤三：吸取梯度稀释液涂布于NA固体培养基上，待吹干后，在30℃的恒温培养箱中倒置培养48h，挑取单菌落，在NA固体培养基上梯度划线再次获得单菌落，将获得的单菌落保存于NA固体培养基试管斜面备用；步骤四：制备LB液体培养液，在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，搅拌直至溶质溶解，用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌21min；步骤五：NA固体培养基试管斜面上挑取单菌落，接种于LB液体培养液中，在180rpm、37℃的条件下振荡培养48h，然后在4℃、10000rpm/min离心15min，去除菌体，保留上清液，取500mL上清液溶于500mL、饱和度为80％的(NH4)2SO4溶液中，放于4℃冰箱静置48h，析出絮凝状沉淀物，所述的絮凝状沉淀物再次在4℃，10000rpm/min离心15min，弃去上清液，保留沉淀物，用500mLPBS缓冲液悬浮沉淀物，并置于透析袋中透析过滤，析出物经过0.22um的细菌滤膜过滤，得到粗提蛋白质液；步骤六：水稻种子用质量浓度70％的乙醇溶液浸泡2min，然后用质量浓度3％的次氯酸钠水溶液浸泡30min，期间用玻璃棒搅动，无菌水冲洗3次，第3次冲洗持续10min，过夜干燥，置于铺有两层湿润滤纸片的培养皿中，再放于37℃恒温培养箱培养4d直至发芽，最后将发芽的水稻种子播种于田地，在水稻生长的第10、20、50和80天向水稻叶面喷洒粗提蛋白质液。优选的，步骤一中所述的梯度稀释共稀释2次，每次稀释2倍。优选的，步骤五中所述的所述的透析袋规格为25KD。优选的，所述的单菌落为芽胞杆菌。本专利技术的有益效果在于：1)芽胞杆菌能够分泌抗菌物质来抑制病原菌生长，并诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，供试菌株对稻瘟病菌分生抱子的萌发、芽管的延长和附着胞的形成具有显著的抑制作用，本专利技术的菌株活性物质对稻瘟病菌有较强的抑制作用，对稻瘟病菌菌丝生长抑制率达到80％以上。2)本专利技术的方法可以调控水稻植株的生长发育进程，包含有益的细茵群落在植株生长中具有促生、抗病、抗逆等功能。根据植物微生态理论，这些细菌和宿主之间在长期的进化过程中能够建立互惠互利的关系。从生物间巧生互作等关系考虑，这些细菌将更有利于生物的定殖，可更好地发挥生防作用。3)本专利技术采用生物防治是发展绿色水稻产业的重要手段，芽胞杆菌是防治稻瘟病的重要生防微生物。从植物中寻找具有生物活性的化合物，直接将其发成为新农药，是目前农药研发的一条重要途径。具体实施方式下面通过对实施例的描述，对本专利技术作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本专利技术的专利技术构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。实施例1一种稻瘟病的生物防治方法，包括以下步骤：步骤一：选取健康水稻叶片，剪成5cm的叶段，放入装有质量浓度75％乙醇的三角瓶中振荡洗涤2次后倒掉乙醇，加入无菌水浸泡30min后梯度稀释，得梯度稀释液；步骤二：制备NA固体培养基，采用蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、葡萄糖2.5g，加蒸馏水溶解，定容至1L，PH调至7±0.1，分装后121℃灭菌20min；步骤三：吸取梯度稀释液涂布于NA固体培养基上，待吹干后，在30℃的恒温培养箱中倒置培养48h，挑取单菌落，在NA固体培养基上梯度划线再次获得单菌落，将获得的单菌落保存于NA固体培养基试管斜面备用；步骤四：制备LB液体培养液，在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，搅拌直至溶质溶解，用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌21min；步骤五：NA固体培养基试管斜面上挑取单菌落，接种于LB液体培养液中，在180rpm、37℃的条件下振荡培养48h，然后在4℃、10000rpm/min离心15min，去除菌体，保留上清液，取500mL上清液溶于500mL、饱和度为80％的(NH4)2SO4溶液中，放于4℃冰箱静置48h，析出絮凝状沉淀物，所述的絮凝状沉淀物再次在4℃，10000rpm/min离心15min，弃去上清液，保留沉淀物，用500mLPBS缓冲液悬浮沉淀物，并置于透析袋中透析过滤，析出物经过0.22um的细菌滤膜过滤，得到粗提蛋白质液；步骤六：水稻种子用质量浓度70％的乙醇溶液浸泡2min，然后用质量浓度3％的次氯酸钠水溶液浸泡30min，期间用玻璃棒搅动，无菌水冲洗3次，第3次冲洗持续10min，过夜干燥，置于铺有两层湿润滤纸片的培养皿中，再放于37℃恒温培养箱培养4d直至发芽，最后将发芽的水稻种子播种于田地，在水稻生长的第10、20、50和80天向水稻叶面喷洒粗提蛋白质液。步骤一中所述的梯度稀释共稀释2次，每次稀释2倍。步骤五中所述的所述的透析袋规格为25KD。所述的单菌落为芽胞杆菌。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稻瘟病的生物防治方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：选取健康水稻叶片，剪成5cm的叶段，放入装有质量浓度75％乙醇的三角瓶中振荡洗涤2次后倒掉乙醇，加入无菌水浸泡30min后梯度稀释，得梯度稀释液；步骤二：制备NA固体培养基，采用蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、葡萄糖2.5g，加蒸馏水溶解，定容至1L，PH调至7±0.1，分装后121℃灭菌20min；步骤三：吸取梯度稀释液涂布于NA固体培养基上，待吹干后，在30℃的恒温培养箱中倒置培养48h，挑取单菌落，在NA固体培养基上梯度划线再次获得单菌落，将获得的单菌落保存于NA固体培养基试管斜面备用；步骤四：制备LB液体培养液，在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，搅拌直至溶质溶解，用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌21min；步骤五：NA固体培养基试管斜面上挑取单菌落，接种于LB液体培养液中，在180rpm、37℃的条件下振荡培养48h，然后在4℃、10000rpm/min离心15min，去除菌体，保留上清液，取500mL上清液溶于500mL、饱和度为80％的(NH4)2SO4溶液中，放于4℃冰箱静置48h，析出絮凝状沉淀物，所述的絮凝状沉淀物再次在4℃，10000rpm/min离心15min，弃去上清液，保留沉淀物，用500mLPBS缓冲液悬浮沉淀物，并置于透析袋中透析过滤，析出物经过0.22um的细菌滤膜过滤，得到粗提蛋白质液；步骤六：水稻种子用质量浓度70％的乙醇溶液浸泡2min，然后用质量浓度3％的次氯酸钠水溶液浸泡30min，期间用玻璃棒搅动，无菌水冲洗3次，第3次冲洗持续10min，过夜干燥，置于铺有两层湿润滤纸片的培养皿中，再放于37℃恒温培养箱培养4d直至发芽，最后将发芽的水稻种子播种于田地，在水稻生长的第10、20、50和80天向水稻叶面喷洒粗提蛋白质液。...

【技术特征摘要】
1.一种稻瘟病的生物防治方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：选取健康水稻叶片，剪成5cm的叶段，放入装有质量浓度75％乙醇的三角瓶中振荡洗涤2次后倒掉乙醇，加入无菌水浸泡30min后梯度稀释，得梯度稀释液；步骤二：制备NA固体培养基，采用蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、葡萄糖2.5g，加蒸馏水溶解，定容至1L，PH调至7±0.1，分装后121℃灭菌20min；步骤三：吸取梯度稀释液涂布于NA固体培养基上，待吹干后，在30℃的恒温培养箱中倒置培养48h，挑取单菌落，在NA固体培养基上梯度划线再次获得单菌落，将获得的单菌落保存于NA固体培养基试管斜面备用；步骤四：制备LB液体培养液，在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，搅拌直至溶质溶解，用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌21min；步骤五：NA固体培养基试管斜面上挑取单菌落，接种于LB液体培养液中，在180rpm、37℃的条件下振荡培养48h，然后在4℃、10000rpm/min离心15min，去除菌体...

【专利技术属性】
技术研发人员：章云，张贝尼，
申请(专利权)人：安徽省中日农业环保科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34