一种探针系统及其制备方法与用途技术方案

本发明专利技术公开一种探针系统的制备方法，主要步骤为：用无水乙醇分别将磷脂聚乙二醇活性脂DSPE‑PEG‑NHS、聚乙二醇维生素E琥珀酸酯TPGS和胆固醇溶解，混合，将混合物搅拌并减压旋转，制备脂质体。取荧光分子溶解在双蒸水中，滴加入到所述脂质体中，超声处理，得到包裹荧光分子的脂质体。将2’‑氨基葡萄糖水溶液与包裹荧光分子的脂质体反应，生成由外部共价连接氨基葡萄糖，内部包裹荧光分子的脂质体形成的探针系统，该探针系统能够良好地靶向识别肿瘤细胞和肿瘤组织，可作为肿瘤靶向的工具。

A probe system and its preparation methods and uses

The invention discloses a preparation method of a probe system. The main step is to mix the phospholipid polyethylene glycol active fat DSPE PEG NHS, the polyethylene glycol vitamin E succinate TPGS and the cholesterol, and mix, stir and decompress the mixture, and prepare the liposomes. The fluorescent molecules were dissolved in double evaporated water, and the droplets were added to the liposomes, and the liposomes coated with fluorescent molecules were obtained by ultrasonic treatment. The 2 'glucosamine solution is reacted with the liposomes encapsulated by fluorescent molecules to produce a probe system which is formed by the external covalently linked glucosamine and encapsulated in the liposomes of the fluorescent molecules. The probe system can target the identification of tumor cells and tumor tissues well, and can be used as a tumor targeting tool.

【技术实现步骤摘要】
一种探针系统及其制备方法与用途
本专利技术属于医学领域，涉及一种靶向性荧光探针系统及其制备方法与用途，特别涉及一种能够靶向结合肿瘤组织的荧光探针系统及其制备方法。
技术介绍
目前在临床上常规诊疗方法有血液学检查、医学影像学检查等，其中医学影像学在现代肿瘤医学检查中扮演着十分重要的角色。随着医学影像学检测技术的革新和迅猛发展，如多排螺旋CT仪器，可精确到一个断层1毫米对人体进行全方位的扫描，还可仿真内镜检查，使早期发现小组织肿瘤成为现实。而以11C、13N、15O、18F等正电子核素为示踪剂的PET-CT检测手段在一定意义上被称为靶向性检测，放射治疗肿瘤可杀死肿瘤细胞，但大剂量的辐射也会造成组织器官的破坏、坏死。因此应用核素检测肿瘤会给人机体带来一定的风险，有些肿瘤病人，在经历了漫长的放射治疗后，或是做多次后续性辐射检查，由于体内的核素不能及时代谢出体外，当辐射剂量累积到一定程度时，很容易引起机体细胞组织再次癌变。肿瘤诊断研究的不断发展伴随着多种显像技术的不断引进，其中荧光成像技术也越来越成为研究热点。动物模型已经广泛应用于基础和临床前研究，结合荧光成像技术能够更精确地指导肿瘤模型动物实验，成为肿瘤诊断的一种非常有价值的工具。目前荧光成像越来越多的用于监测体内分子的行为，成像运用的范围从细胞、组织水平发展到全身水平，并有可能用于临床研究。近期分子影像学的许多发展已经使人们对活体内特异分子作用靶点和分子作用路径有了更直观形象的认识。介于分子成像技术的快速发展，研究者将其运用到了体内更多的生理病理特征变化的检测中，在肿瘤的相关研究中，不仅能使临床研究者直观地诊断肿瘤位于身体的哪个位置，还能检测到特异性的分子(如朊酶类和蛋白激酶类)的功能和活性，以及反映肿瘤治疗过程中的生物学变化(如细胞凋亡、血管生成和肿瘤转移)。荧光成像技术将在肿瘤的研究中发挥越来越大的作用，它对肿瘤的诊断、个体化治疗、药物的研发和肿瘤发生机理的研究和应用都有巨大的意义。荧光光学成像是医学影像技术中的重要技术之一，当今荧光成像特别是近红外染料越来越多的用于监测体内分子的行为，成像运用的范围从细胞、组织水平发展到全身水平，并有可能用于临床研究。近年来随着分子影像学的不断发展，荧光光学活体成像使人们直观观察到以体内特异分子作为靶点的直接效应，同时对分子作用途径也有了更加深刻地认识。大多数荧光染料在体内半衰期较短，且对肿瘤组织没有特异性，因此可将荧光染料结合一些“导向性基团”并用生物相容性材料脂质体制备成纳米靶向性荧光探针，以增加生物相容性，延长荧光染料在体内的半衰期，并具有一定的靶向性，如将具有靶向性荧光分子探针注入体内，通过体内的荧光信号强度诊断肿瘤的早期组织。现有技术缺点之一：所用材料PLGA虽然已被FDA批准上市，但由PLGA所制备的纳米颗粒粒径较大并分散性差，无靶向性，使纳米颗粒多集中于肺部和肝部，很难锁定肿瘤部位。缺点之二：目前在临床上辅助手术的示踪剂是注射吲哚荧光染料菁绿ICG,用于诊断肝硬化、肝纤维化、韧性肝炎、职业和药物中毒性肝病等各种肝脏疾病，了解肝脏的损害程度及其储备功能。用于脉络膜血管造影，确定脉络膜疾患的位置，但对肿瘤组织无特异性靶向，且在全身分散。临床所开发的靶向性荧光示踪剂多为主动靶向性荧光探针，在众多主动靶向研究中，较成熟的主动靶向小分子配体叶酸具有较好的靶向性，但肾脏大量表达叶酸受体，因此由叶酸靶向的小分子药物和探针会聚集在肾脏引起肾毒性，叶酸共价偶联药物和探针的肾聚集是限制叶酸靶向性药物和探针在临床上使用的最大障碍，此问题一直没有被解决。前期研究工作中，制备2-氨基葡萄糖-FITC荧光探针和2-氨基葡萄糖-ICG02近红外荧光探针，从细胞水平和动物水平研究荧光探针的靶向性。实验结果证明已成功合成2-氨基葡萄糖-谷氨酸-荧光染料FITC/近红外荧光探针，细胞和动物实验表明在葡萄糖转运蛋白受体-配体作用的介导下，2-氨基葡萄糖荧光探针可靶向葡萄糖转运蛋白受体高表达的肿瘤细胞和组织。将2-氨基葡萄糖共价偶联荧光染料，制备小分子荧光探针，具有较好靶向性。2-氨基葡萄糖荧光探针的制备及肿瘤靶向性的研究已发表在《中国临床药理学与治疗学》2016，12.缺点之一：一个小分子探针只能共价偶联2个氨基葡萄糖分子，缺点之二：小分子探针在体内循环较快，且荧光染料在体内容易发生荧光淬灭现象。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利用脂质体包裹荧光染料，主要是防止荧光染料在体内淬灭，在制备脂质体时将PEG-NHS镶嵌在脂质体骨架，使其更多地共价偶联氨基葡萄糖，增加荧光探针的靶向性，使用PEG分子量由2000-20K，用于延长靶向性探针在体内的循环时间制备N-氨基葡萄糖-脂质体纳米靶向性荧光探针。恶性肿瘤细胞存在有氧获能障碍，其代谢的重要特点是以葡萄糖为唯一的底物进行无氧酵解，从而获取能量，这也是肿瘤细胞唯一的获能方式，即“Warburg”效应。而正常细胞有三大类产能底物：葡萄糖、脂肪和蛋白质，在供氧充足情况下以有氧代谢为主获取能量，除葡萄糖外还可以脂肪、蛋白质为底物产能，故针对肿瘤糖酵解的抗肿瘤诊断或治疗具有肿瘤细胞特异性，对正常细胞影响很小，不损伤正常细胞。葡萄糖在生物学领域具有重要地位，是生物体内新陈代谢不可缺少的能源物质，是活细胞的能量来源和新陈代谢的中间产物，在医药领域有着广泛应用。葡萄糖进入血液循环后，在体内代谢首先需要进入细胞，这是依赖葡萄糖转运体(glucosetransporter，Glut)而实现的。肿瘤细胞代谢旺盛，对葡萄糖的代谢率增高，需求量增加，这主要与Glut1的表达、酶活性、肿瘤恶性程度、浸润和转移能力及环境因素等相关。Glut1是介导细胞葡萄糖摄取的主要载体，与正常细胞相比，肿瘤细胞Glu1t的表达和活性明显增强。肿瘤细胞代谢需要摄取大量葡萄糖，因此以显像剂标记葡萄糖，结合显像技术在肿瘤诊断方面具有良好的应用前景。恶性肿瘤细胞代谢旺盛，其获得能量的重要方式是以葡萄糖为唯一的底物进行无氧酵解，为了获得更多能量，恶性肿瘤细胞表面高表达葡萄糖转运蛋白受体，因此可将葡萄糖转运蛋白作为靶向靶点。由葡萄糖转运蛋白可识别的配体小分子用于肿瘤的诊断工具，而靶向葡萄糖转运蛋白的载体所承载的药物则可以用作肿瘤的靶向给药工具。氨基葡萄糖是葡萄糖一个2’位羟基被氨基取代的2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖化合物，其结构与氨基葡萄糖相似，在恶性肿瘤能量代谢中，能被恶性肿瘤细胞表面高表达的葡萄糖转运蛋白识别靶向恶性肿瘤，其靶向性具有广谱性。因此，将氨基葡萄糖共价偶联包裹荧光染料的纳米脂质体可构成靶向恶性肿瘤的荧光探针系统。恶性肿瘤细胞代谢旺盛，获能的重要方式是以葡萄糖为唯一的底物的无氧酵解，其细胞表面高表达葡萄糖转运蛋白受体，本专利将葡萄糖转运蛋白作为靶点，氨基葡萄作为导向基团，使纳米靶向性荧光探针的性具有广谱性，可靶向多种恶性肿瘤细胞，使用DSPE-PEG-NHS作为制备脂质体的材料，在共价偶联氨基葡萄糖的同时，PEG可增加脂质体在体内循环时间，纳米脂质体包裹递送物质荧光分子可防止荧光染料在体内淬灭或荧光强度下降等问题。为了解决现有技术中的问题，基于上述核心构思，本专利技术提供了一种一种探针系统的制备方法，所述探针系统包括脂质体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种探针系统的制备方法，其特征在于：所述探针系统包括脂质体，荧光分子和氨基葡萄糖，所述荧光分子位于所述脂质体内部，所述氨基葡萄糖连接于所述脂质体外部。

【技术特征摘要】
1.一种探针系统的制备方法，其特征在于：所述探针系统包括脂质体，荧光分子和氨基葡萄糖，所述荧光分子位于所述脂质体内部，所述氨基葡萄糖连接于所述脂质体外部。2.如权利要求1所述的探针系统的制备方法，其特征在于：所述探针系统的制备步骤包括：将所述荧光分子包裹到所述脂质体当中；将2’-氨基葡萄糖共价结合于包裹有所述荧光分子的脂质体外部骨架分子上。3.如权利要求1所述的探针系统的制备方法，其特征在于：所述探针系统的制备步骤包括：所述脂质体的制备方法为：用无水乙醇分别将磷脂聚乙二醇活性脂DSPE-PEG-NHS、聚乙二醇维生素E琥珀酸酯TPGS和胆固醇溶解；将所述聚乙二醇活性脂DSPE-PEG-NHS、所述聚乙二醇维生素E琥珀酸酯TPGS和所述胆固醇的乙醇溶液搅拌并减压旋转，制备所述脂质体。4.如权利要求1所述的探针系统的制备方法，其特征在于：使所述荧光分子位于所述脂质体内部的步骤包括：取所述荧光分子溶解在双蒸水中，滴加入到所述脂质体中，超声处理，得到包裹所述荧光分子的所述脂质体。5.如权利要求4所述的探针系统的制备方法，其特征在于：使所述荧光分子位于所述脂质体内部的步骤还包括：将包裹所述荧光分子的所述脂质体通过聚碳酸纤维膜挤压后得到粒径为聚碳酸纤维膜孔径的包裹所述荧光分子的所述脂质体。6.如权利要求1所述的探针系统的制备方法，其特征在于：所述荧光分子选自ICG,亚甲蓝，荧光素纳，5-ALA，FITC，罗丹明。7.如权利要求1所述的探针系统的制备方法，其特征在于：所述探针系统的制备步骤为：(1)将磷脂聚乙二醇活性脂DSPE-PEG-NHS，聚乙二醇维生素E琥珀酸酯TPGS和胆固醇分别配制成乙醇溶液，按照溶质摩尔比95-90:10-5:5-1均匀混合在一起，置于45-55℃的水浴中搅拌使所述磷脂聚乙二醇活性脂DSPE-PEG-NHS，所述聚乙二醇维生素E琥珀酸酯TPGS和所述胆固醇溶解混匀，并在45-55℃水浴条件下减压旋转蒸发乙醇，形成脂质体；(2)将所述荧光分子配制成水溶液并滴加到所述脂质体中，在45-55℃的水浴中超声，使荧光分子包裹在所述脂质体中，形成脂质体包裹荧光分子的脂质体荧光分子复合体；(3)在45-55℃水浴中，用挤压法将所述脂质体荧光分子复合体通过聚碳酸纤维膜挤压后得到粒径为聚碳酸纤维膜孔径的脂质体荧光分子复合体；(4)将2’-氨基葡萄糖溶解在水中，按照2’-氨基葡萄糖：磷脂聚乙二醇活性脂DSPE-PEG-...

【专利技术属性】
技术研发人员：单玲玲，
申请(专利权)人：单玲玲，
类型：发明
国别省市：安徽,34