一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法与应用。涉及对植物化学物质、抗衰老药物及保健品等的性能评价方法。本发明专利技术在没有毒性的浓度下，评估待测物质的抗衰老效果。采用本评估方法，能够在短期内评价待测物质是否具有抗衰老活性。主要通过检测秀丽隐杆线虫的寿命，热应激能力，抗紫外辐照能力，抗氧化损伤能力，繁殖力，身体长度以及脂褐素含量来进行评价。本发明专利技术的优点在于模式生物秀丽隐杆线虫生长周期短，抗衰老效果在数周内可迅速观察，实验周期短，操作简便。

An antiaging evaluation method and application based on model nematode

The invention discloses a method and application of anti aging evaluation method based on the model organism Caenorhabditis elegans. It involves the evaluation of the performance of phytochemicals, antiaging drugs and health care products. In the present invention, the antiaging effect of the substances to be measured is evaluated without toxic concentration. This evaluation method can be used to evaluate the antiaging activity of the material to be tested in the short term. Mainly through the detection of Caenorhabditis elegans lifespan, heat stress, anti ultraviolet radiation, oxidative damage, fecundity, body length and lipofuscin content to evaluate. The advantages of the invention are that the growth period of the model organism is very short, and the anti-aging effect can be observed quickly within a few weeks. The experimental cycle is short and the operation is simple.

【技术实现步骤摘要】
一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法与应用
本专利技术属于动物模型
，具体涉及一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法与应用。
技术介绍
衰老被定义为各项功能和对环境的适应能力的丢失。社会概念上的衰老包含由于行动力，意识和感觉功能等独立生活能力的丧失。衰老可导致疾病的发生包括肿瘤，心血管疾病，代谢疾病以及神经退行性疾病。由于这些条件的影响，人们对老年人的尊敬和崇拜已经被推迟，停止，甚至扭转。市场上推广的通过饮食，运动，补充和激素治疗可延缓衰老的副作用的抗药物受到广泛的关注。衰老是一个受多方面因素调控的过程，许多理论试图去解释这一过程。目前为止，衰老的生物机制的研究尚不明确。氧化应激，细胞老化和慢性炎症都可能是诱导衰老的因素。自由基是产生细胞氧化应激的主要因素，自由基是氧气和氮气的中间态，可以损伤细胞膜和内部结构，1956年，Harman提出自由基在衰老中的作用。正常的细胞代谢可以产生自由基，并被细胞内自身的还原剂清除，如谷胱甘肽。在快速呼吸过程中，中性粒细胞释放大量的超氧离子形成过氧化氢和次氯酸以中和体内的入侵物质，如细菌，同时约1-2%的氧气在呼吸作用过程中形成活性氧ROS。在呼吸作用过度或不正常激活的情况下，氧化剂与还原剂种类的比例提高可导致细胞损伤。这是由于中性粒细胞在调节ROS产生过程中信号转导级联介质cGMP和cAMP的不平衡导致的。并且50岁以上的人体细胞中前炎症因子cGMP的活性高于抗炎症因子cAMP。另外，ROS可影响蛋白质的稳态，促进细胞内损伤的蛋白积累可进一步导致蛋白的错误折叠和聚合，同时有研究表明胰岛素样生长因子信号通路可保护神经细胞免受蛋白毒性。1961年，Hayflich首次阐述细胞衰老，对衰老机制的研究做出了重要贡献。在细胞复制过程中，由于DNA的不完全复制和末端的降解，总会有一小部分的端粒DNA的丢失，端粒DNA的长度随着复制代数的增加而缩短，当端粒DNA的长度缩短到一定的限度后，细胞就会出现不可逆的局限和停滞。由于细胞分化的缺陷，已经损伤细胞不可能被新的细胞替换，随之细胞出现衰老。另外由于端粒长度的缩减，DNA的损伤，肿瘤的形成，以及肿瘤抑制剂的刺激导致细胞的衰老。肿瘤抑制基因P53在肿瘤形成过程中也被激活。同时小鼠实验研究表明：P53的过表达可诱导衰老并且大大缩短了小鼠的寿命。免疫系统可清除年轻个体中的衰老细胞，但是在衰老个体中衰老细胞被新的衰老细胞代替，使这一过程似乎停滞或淹没。人类对衰老机制的研究始于整体水平和器官水平，主要表现为机体形态结构和功能两方面出现的一系列退行性改变，细胞凋亡或坏死导致细胞数量减少，脏器萎缩，组织弹性减低等，从而进一步引起多种器官生理功能的逐步减退。各种学说认为无论是从生物个体水平，还是从细胞与分子水平，它们相互之间并非对立，而是互为因果、相互补充或同时作用，但都有其局限性。秀丽隐杆线虫是一种常见的、自由生活的小型土壤线虫。在理想的条件下（充足食物，20℃）生命周期很短，大约为4天。秀丽隐杆线虫成体长1-1.5mm，体宽约70μm，全身透明，以细菌为食，全身共有959个细胞。卵在通过受精囊时受精形成一层坚硬的几丁质的外壳，在母体内就开始分裂。从母体产出的卵大约处于30个细胞期。胚胎发生很有规律，从卵中孵化出约有550个细胞的幼虫。从孵化到成虫，线虫要经历4个幼虫阶段（L1～L4）和4次蜕皮，这个过程中身体大小和细胞数目两方面都有增长。蜕皮的时间（20℃）分别是孵化后13、21.5、29.5和41h；身体长度分别是350、470、640和890μm。秀丽隐杆线虫孵化后约50h开始产卵，每个雌雄同体可产200到300卵。研究用的通常是秀丽隐杆线虫野生型（N2）。秀丽隐杆线虫性别是由常染色体和性染色体组的比例决定，有两种性别形式：雌雄同体和雄虫。雌雄同体的性染色体为XX，而雄虫性染色体为X0。雌雄同体的秀丽隐杆线虫既产生卵，又产生精子，可以与雄体交配，也可以自体受精进行繁殖，但雌雄同体之间不能异体受精。在雌雄同体自交繁殖中以0.2%的频率产生雄体（是减数分裂时性染色体不分开造成的）；而雄体与雌雄同体交配其后代两种性别比例为1:1。从1965年开始，SydneyBrenner以线虫为材料研究发育和神经生物学，现在已经成为经典模式生物之一。1974年SydneyBrenner绘制了秀丽隐杆线虫的基因图谱。此后进行了一系列对秀丽隐杆线虫生物学功能的研究包括细胞程序化死亡的分析、全DNA序列的解码以及基因组系统克隆等方面。在过去的30年间，衰老分子机制的研究慢慢成为研究工作的焦点，而秀丽隐杆线虫成为主要的模式生物，从最初的对增寿单基因突变的鉴定，到对胰岛素样生长因子信号通路影响寿命作用的发现，为当前许多对衰老分子机制的理解提供了基础和最初的观察。秀丽隐杆线虫之所以可以作为研究衰老调控机制十分有用的模式生物，主要在于线虫随着年龄的增加，会表现出行为迟缓，生理功能减退等现象，这一点与高等哺乳动物十分相似，当然也包括人类。当秀丽隐杆线虫逐渐衰老，会出现肌肉萎缩，肌组织逐渐受损，体内氧化蛋白和脂褐质的逐渐积累，衰老的特征普遍与其他物种类似。在衰老相关的基因与蛋白水平，秀丽隐杆线虫与人类具有80%的同源性。其生命周期短暂，适合短期内构建验证实验。同时秀丽隐杆线虫也是研究药物药理学和药物影响基因表达的理想的模式生物。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的不足，本专利技术的首要目的在于提供一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法。本专利技术的另一目的在于提供上述抗衰老评价方法的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现。一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法，包括如下步骤：向涂布有大肠杆菌OP50的NGM培养板中加入待测物质，再加入秀丽隐杆线虫培养，观察秀丽隐杆线虫的生存状况。优选的，所述待测物质的用量为100μL。优选的，所述待测物质的浓度为50mg/mL，100mg/mL和200mg/mL。优选的，所述加入待测物质的方式是液体给药。优选的，所述液体给药的具体方式为：在挑取秀丽隐杆线虫之前半个小时，取待测物质加到NGM培养板的大肠杆菌OP50上。优选的，所述待测物质为蓝莓提取物。优选的，所述秀丽隐杆线虫是年轻成虫期的秀丽隐杆线虫。优选的，所述培养的温度为20℃。优选的，所述观察秀丽隐杆线虫的生存状况包括观察秀丽隐杆线虫的寿命，热应激能力，抗紫外辐照能力，抗氧化损伤能力，繁殖力，身体长度以及脂褐素含量，再确定模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老模型构建方法的稳定性和可靠性，确定最佳的实验条件，即获得低损伤性，高效，稳定，可靠的模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老模型。由以上所述的一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法在筛选抗衰老药物或保健品中的应用。优选的，一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法，包含如下步骤：1、大肠杆菌OP50的活化和涂平板（1）打开超净工作台的紫外灯5min，之后关闭紫外灯开始无菌操作。取一个无菌的15mL离心管，用移液器加入10mLLB液体培养基，再向其中加入100μL大肠杆菌OP50。将15mL离心管放入37℃恒温摇床中振荡培养过夜（8～12h）。（2）大肠杆菌OP50涂平板大肠杆菌OP50振荡培养过夜后，操作之前打开超净本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法，其特征在于，包括如下步骤：向涂布有大肠杆菌OP50的NGM培养板中加入待测物质，再加入秀丽隐杆线虫培养，观察秀丽隐杆线虫的生存状况。

【技术特征摘要】
1.一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法，其特征在于，包括如下步骤：向涂布有大肠杆菌OP50的NGM培养板中加入待测物质，再加入秀丽隐杆线虫培养，观察秀丽隐杆线虫的生存状况。2.根据权利要求1所述的一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法，其特征在于，所述待测物质的用量为100μL。3.根据权利要求1所述的一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法，其特征在于，所述待测物质的浓度为50mg/mL，100mg/mL和200mg/mL。4.根据权利要求1所述的一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法，其特征在于，所述加入待测物质的方式是液体给药。5.根据权利要求4所述的一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法，其特征在于，所述液体给药的具体方式为：在挑取秀丽隐杆线虫之前半个小时，取待...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭新波，王怀玲，刘瑞海，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44