用于降解不溶性和可溶性草酸的高效草酸降解酶制造技术

本发明专利技术揭示了酶通过pH值和热稳定性诱导草酸盐以及在食品加工中与草酸盐相关条件的使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于降解不溶性和可溶性草酸的高效草酸降解酶专利
本专利技术涉及催化性高效草酸降解酶(草酸脱羧酶，OxDC)。本专利技术解决了有效降解不溶性和可溶性草酸钙的问题，其中，与先前的发现和报道的相比，OxDC酶对草酸盐具有更高的亲和性(Km是以微摩尔与毫摩尔的比值计)。本专利技术还提供了证据证明为什么一些OxDC酶在，例如pH值1.5-5.0的酸性条件下，更加稳定和更具活性，并且给出不稳定性的原因是由于蛋白质的四级结构丢失造成。本专利技术还提供了证据证明包入三聚体的第一草酸脱羧酶。本专利技术还涉及从食品(例如面粉、面包、罐装蔬菜、馅饼等)和饮料(例如茶、啤酒、果汁等)中降低草酸盐(又名草酸)的浓度和/或完全去除草酸，从而减少从日常食品中摄入的草酸。这实质上建立了一系列低草酸与无草酸的食品和饮料，这些食品和饮料可以帮助人们更好地管理与草酸相关的疾病的状况和/或者让健康的人群具有更富营养的饮食(草酸被认为是一种抗营养素)。本专利技术进一步涉及用来使所述酶固定化的方法，这既为了将酶在趋于高温时进行稳定，同时也可以对相同的酶进行重新利用来处理多个批次的食品和饮料(即，实现所述酶的循环利用)。本专利技术进一步涉及用于对所述酶进行配方的方法，这既为了稳定所述酶，同时也可以通过新配方来准备所处的pH环境。本专利技术进一步涉及对所述酶和所述配方在用于治疗、工业、生物技术、化学、物理或其他相关应用领域、特别是治疗制剂(如医药制剂和营养品制剂)的酶颗粒的制备中的使用。本专利技术还包括含有未按配方配制或按配方配制的高效酶的医药和食品组合物。本专利技术进一步涉及所述酶作为食品加工助剂、食品添加剂、工业或其他相关应用领域的使用。本专利技术包括所述酶在食品制造过程中的使用。本专利技术还包括所述酶在工业生产过程(制浆和造纸、化学等)中的使用。本专利技术还涉及这些组合物在治疗有需要的主体的方法中的使用，其中，所述方法包括服用包含一种或多种所述高效酶或者所述一种或多种按配方配制的酶的药物或营养组合物。
技术介绍
草酸盐是一种小有机二羧酸的盐。其具有两个酸离解常数点：pH1.25和4.14。因此，在pH值降低的情况下，更多的草酸盐将以单质子化或草酸存在，并且与例如钙这样的二价反荷离子的亲和力降低，从而导致溶解度增加。不溶性草酸盐是指草酸盐离子(C2O42+)通过离子相互作用而强束缚于例如钙(Ca2+)这样的反荷离子上。由于草酸盐是一种弱有机酸，其溶解度在很大程度上取决于pH值。酸的酸离解常数等于酸及其相应碱以同等量存在时的pH值。草酸是二羧酸(两个酸基)，因此，其具有两个酸离解常数点：pH1.25和pH4.14。因此，随着pH值的降低，草酸盐会以单质子化(HC2O41-)或草酸的形式存在，并且与钙的亲和性降低，从而导致溶解度增加。草酸盐是哺乳动物的代谢终产物。草酸盐也可以通过饮食摄入，因为它通常存在于植物中，主要存在于树叶、坚果、果实和树皮中。因此，哺乳动物具有两种草酸盐的来源：内源性(源于身体的新陈代谢)或外源性(源于饮食)。草酸盐在胃中就开始吸收，并在小肠达到最大吸收量。研究显示草酸盐摄入后20分钟，草酸盐尿排泄率即刻上升，并且在摄入后40分钟和180分钟时，排泄物具有两个明显的峰值。支持在胃中吸收的说法是在胃切除术患者中未检测到第一个草酸盐吸收的峰值。12由于胃中上皮组织的紧密连接3，因此，最大吸收量发生在小肠，这可能受到以下事实的影响：胃中的草酸盐转运可能仅限于跨细胞转运(通过上皮细胞)，而不是在细胞间转运(在细胞之间)。身体无法降解或代谢草酸盐；因此主要通过肾脏排泄。当草酸盐未被充分去除时，草酸盐水平会积聚在血液中，并集中在尿液中，从而导致高草酸尿症(尿中草酸盐含量升高)，并且在严重的情况下引发草酸过多症(组织中沉积草酸盐)，从而造成组织损伤。专利技术概述本文所述的专利技术涉及高催化效率的草酸降解酶(草酸脱羧酶，OxDC)及其在降解可溶性草酸盐和不溶性草酸盐中的使用，其中所述酶被发现具有比在先所公开的高的多的对草酸盐的亲和性(Km以微摩尔与毫摩尔的比值计)。本专利技术还提供证据证明保持自由基不抑制OxDC酶的方法，例如用谷氨酸和添加维生素代替340位的残基(Cb6301，图10)。本专利技术还提供了证据证明为什么一些OxDC酶在例如pH值1.5-5.0的酸性条件下更加稳定和更具活性，以及由于蛋白质的四级结构丢失而造成的不稳定性。本专利技术还提供了天然包进三聚体的第一OxDC的证据以及其包进三聚体的原因。Cb6301在三聚体界面处具有最小量的离子电荷残基和最大量的氢键残基。由于离子相互作用的数量减少以及氢键结合数量增加，Cb6301在本质上将更加稳定。天然包入三聚体的酶(Cb6301、Cb6312和Cb6803)在pH1.5的极端酸性条件下具有增强的稳定性和活性。人们发现剩余包入六聚体的酶主要通过六聚体界面处的离子相互作用作为六聚体结合在一起。另外，这些酶在三聚体界面处还具有较高的离子相互作用。较高的离子相互作用使酶在酸性pH(特别是pH3.0以下)下具有较差的稳定性。而造成稳定性下降的原因是由于在酸性pH条件下天冬氨酸(酸离解常数＝3.65)和谷氨酸(酸离解常数＝4.25)的质子化作用。在这些氨基酸被质子化时，OxDC的蛋白质四级结构解离，从而导致酶的解折叠以及接下来的活性丧失(不可逆事件)。六聚体和三聚体界面处较高的离子相互作用会让这些界面在酸性pH条件下易于解离。本专利技术还描述了重组表达这些酶的方式，这些酶的配方以及药物、特膳食品或由所述按配方配制或未按配方配制的酶制备的医疗食品组合物。本专利技术的另一个实施例是这些组合物在药物、特膳食品的使用或医疗食品等治疗目的中的使用。本专利技术还描述了这些酶在食品加工中从食品(即面包、面粉、罐装蔬菜)、饮料(即啤酒、茶、果汁)以及工业生产过程(即纸浆和纸，化学品)中降解草酸盐的使用。本专利技术的一个实施方案是重组表达的酶和固定化这些酶以便于回收和/或再利用。本专利技术的另一个实施例是这些固定化组合物在食品加工中的使用。本专利技术的另一个实施方案是这些固定化组合物在工业应用中的使用。其他实施例涉及草酸降解酶的固定化，从而为了所期望的应用对所述降解酶进行循环和再利用。所述固定化描述了所述酶如何能够在趋热时增加稳定性。本专利技术描述了草酸降解酶以及其它pH敏感型酶的配方，以使当pH敏感型酶被置于非最适宜pH的环境下时降低活性的损失。即使处于非最适宜pH的条件下，这种新配方仍可通过维持有助于活性的酶周围的微环境而保持活性。本专利技术的一个进一步实施例是使用这些制备的组合物用于治疗和预防疾病，特别是与草酸相关的疾病。附图说明图1.OxDC亚基单位排列。OxDC包入成三聚体的二聚物，从而形成六聚体。三聚体亚基A与亚基B和C都相互作用。六聚体亚基A与六聚体界面上的亚基D以及三聚体界面上的B和C相互作用。图2.三种OxDC酶的热稳定性：杨树菇(“A0”和“A8”)、蜡状芽孢杆菌(“Bce”)和细长聚球蓝细菌(“Cb6301_D29”)。如示例4所描述的，通过将所有活性结果正规化至25℃的活性来计算OxDC的相对活性。图3.两种OxDC酶的pH稳定性：蜡状芽孢杆菌(“Bce”)和细长聚球蓝细菌(“Cb6301_D29”)。如示例5所描述的，通过将所有活性结果正规化至25℃的活性来计算OxDC的相本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含一种或多种在低于3.0的pH值下为三聚体的草酸降解酶的组合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.02 US 62/141,9761.一种包含一种或多种在低于3.0的pH值下为三聚体的草酸降解酶的组合物。2.一种包含至少一种在整个六聚体界面内具有9个或更少的精氨酸和赖氨酸氨基酸的草酸降解酶的组合物。3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述至少一种草酸降解酶被重组表达并且具有与任何一种序列ID号2-40的85％相同的氨基酸序列。4.一种权利要求2的组合物，其中所述至少一种草酸降解酶在pH3.0下是三聚体。5.一种权利要求2的组合物，其中所述至少一种草酸降解酶在pH2.0和更高时具有草酸降解活性。6.一种权利要求2的组合物，其中所述至少一种草酸降解酶在pH2.5下具有1mM或更低草酸盐的Km。7.一种权利要求2的组合物，其中所述至少一种草酸降解酶具有至少7000转化次数/M/s的催化效率。8.包含一种或多种在整个六聚体界面内具有21个或更少的精氨酸和赖氨酸氨基酸的草酸降解酶的组合物。9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述一种或多种草酸降解酶被重组表达，并且具有至少与任何一个序列ID号1和41-43的85％相同的氨基酸序列。10.一种权利要求8的组合物，其中所述一种或多种草酸降解酶在pH3.0下是六聚体。11.一种权利要求8的组合物，其中所述一种或多种草酸降解酶在pH2.5和更高时具有草酸盐降解活性。12.一种权利要求8的组合物，其中所述一种或多种草酸降解酶在pH下具有3mM或更低草酸盐的Km。13.一种权利要求8的组合物，其中，所述一种或多种草酸降解酶具有至少7000转化次数/M/s的催化效率。14.一种包含一种或多种在整个六聚体界面内具有24个或更少精氨酸和赖氨酸氨基酸的草酸降解酶的组合物。15.一种根据权利要求14所述的组合物，其中所述重组表达的草酸降解酶具有至少与任何一个序列ID号44-47的85％相同的氨基酸序列。16.一种权利要求14的组合物，其中所述一种或多种草酸降解酶在pH4.0下是六聚体。17.一种权利要求14的组合物，其中所述一种或多种草酸降解酶在pH3.5和更高时具有草酸盐降解活性。18.一种权利要求14的组合物，其中所述一种或多种草酸降解酶在pH3.5下具有10mM或更低草酸盐的Km。19.一种权利要求14的组合物，其中所述一种或多种草酸降解酶具有至少7000转化次数/M/s的催化效率。20.根据权利要求1、2、8和14的组合物，其中所述一种或多种草酸降解酶被重组表达。21.根据权利要求1、2、8和14的组合物，其中所述一种或多种草酸降解酶具有草酸脱羧酶的活性。22.根据权利要求1、2、8和14的组合物，所述一种或多种草酸降解酶用于降低食品中的草酸盐水平。23.根据权利要求1、2、8和14的组合物，所述一种或多种草酸降解酶用于降低饮料中的草酸盐水平。24.一种使用权利要求1、2、8和14的组合物减少哺乳动物尿中草酸盐的方法，包括给哺乳动物施用减少草酸盐的有效量的组合物。25.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：艾如·B·考利，伊莱娜·考利，颜钦，李青山，
申请(专利权)人：凯普托杰姆有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US