一种牡丹幼胚的组织培养方法技术

本发明专利技术涉及一种牡丹幼胚的组织培养方法，包括如下步骤：1)对盛花期后30天或之后的心皮进行表面消毒，取出心皮中的种子，珠孔朝上，接种于启动培养基上，培养至出现可见胚；所述启动培养基的组成为：改良MS培养基或MS培养基+0.2～0.3mg·L

A tissue culture method for the immature embryo of peony

The present invention relates to a tissue culture method for the young embryo of peony, which includes the following steps: 1) to sterilize the carpel at 30 days after the flowering period, remove the seeds from the carpel, and take the pearl hole up, and inoculate it on the starting medium to produce the visible embryo; the composition of the promoter is: the modified MS medium or the MS culture. Nutrient base +0.2 ~ 0.3mg L

【技术实现步骤摘要】
一种牡丹幼胚的组织培养方法
本专利技术属于组织培养
，具体涉及一种牡丹幼胚的组织培养方法。
技术介绍
牡丹(Paeoniasect.Moutan)，芍药科芍药属牡丹组的木本植物。花朵硕大，花色艳丽，气味芬芳，自古以来被称为“国色天香”、“百花之王”，深受人民喜爱。牡丹因其丰富的花色、花型、花香及深厚悠久的文化而具有极高的观赏价值，同时兼有药用、食用的经济价值。植物在受精后就开始发育。牡丹从开花授粉到种子成熟需约4个月时间，种胚发育经历游离核原胚、细胞化原胚、胚原基发生、球形、心形、马蹄形及子叶形等各个时期(成仿云.紫斑牡丹有性生殖过程研究：[博士学位论文].北京：北京林业大学，1996:1-45)。由于离体胚培养是包括在胚发生过程中，可培养不同发育时期的胚，因而一般可分为幼胚培养和成熟胚培养两种类型，他们对培养条件的要求有极大的差异。成熟胚一般指子叶期后到发育完全的胚，它的培养容易成功。幼胚是指子叶期以前的具有胚结构的幼小胚。幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值。在进行幼胚培养时可产生下述几种情况：①胚性发育：在培养中，胚往往呈现胚性发育，即胚可增大到正常胚大小，甚至大于正常胚。②早熟萌发：未成熟胚不能继续长出成熟胚的各种结构，在培养中迅速萌发成瘦弱或畸形的幼胚。③产生愈伤组织：在胚培养中常能诱发细胞增殖而形成愈伤组织，愈伤组织大致可分为胚性愈伤组织和非愈伤组织两种类型(RaghavanV.OnehundredyearsofzygoticembryocultureinvestigationInVitroCell.Dev.Biol.-plant2003,39；437-442)。芍药属植物的胚培养开始于1969(DemoiseCF,PartanenCR.Effectsofsubculturingandphysicalofmediumonthenuclearbehaviorofaplanttissueculture.Amer.J.Bot.1969,56(2):147-152)，之后多年采用不同基因型的成熟胚及不同培养基与PGRS配比，通过三条途径获得再生植株。但关于幼胚培养的成功的案例极少：芍药属芍药：BrukhinVB和BatyginaTB(BrukhinVB,BatyginaB.EmbryocultureandsomaticembryogenesisincultureofPaeoniaanomala[J].Phytomorphology,1994,44(3-4):151-157.)用处于不同生长时期的Paeoniaanomala种胚(授粉后23～45d)为外植体进行胚培养。试验发现只有选球状胚阶段之后的胚状体培养才能增殖，取自成熟种子的胚在无激素的MS和1/2MS培养基上均能形成正常的小植株，而早期鱼雷形胚和心形胚只有25％形成小植株。芍药属牡丹：何桂梅(何桂梅.牡丹远缘杂交育种及胚培养与体细胞胚发生的研究[D].北京林业大学博士论文，2006)研究发现牡丹花后90d的近成熟胚胚最快可在5周内成苗，刚完成器官分化的早期子叶胚(约60-65d)也可很快离体培养成苗，但早期的胚珠(≤48d)便难以成活。现有技术中，灭菌阶段便存在对心皮灭菌，污染率高，对种子灭菌，伤害外植体的难题；其次是离体的外植体及幼嫩种子的褐化问题，何桂梅发现花后48d及之前采收的种子，在15天内全部褐化死亡；而且
技术介绍
并没有取得牡丹极早期幼胚的成活，65天后采收的种子才可成活。(何桂梅.牡丹远缘杂交育种及胚培养与体细胞胚发生的研究[D].北京林业大学博士论文，2006)
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种牡丹幼胚的组织培养方法，本专利技术的方法可将早期幼胚离体培养成功，使得离体的幼胚维持胚性生长途径，进一步的诱导成苗。本专利技术的方法包括如下步骤：1)对盛花期后最早30天的心皮进行表面消毒，取出心皮中的种子，珠孔朝上，接种于启动培养基上，培养至出现可见胚；所述启动培养基的组成为：改良MS培养基或MS培养基+0.2～0.3mg·L-1BA+0.2～0.3mg·L-1GA；2)将所述可见胚接种于成苗培养基中，至培养生出幼苗；所述改良MS培养基的组成包括：大量元素CaCl2·2H2O8800mgL–1、KH2PO41700mgL–1、KNO319000mgL–1、MgSO4·7H2O3700mgL–1、NH4NO316500mgL–1；微量元素CoCl2·6H2O5mgL–1、CuSO4·5H2O5mgL–1、Na2EDTA7460mgL–1、FeSO4·7H2O5560mgL–1、H3BO31240mgL–1、KI166mgL–1、MnSO4·H2O4460mgL–1、Na2MoO4·2H2O50mgL–1、ZnSO4·7H2O1720mgL–1；有机成分Myo-Inositol20000mgL–1、Nicotinicacid100mgL–1、PyridoxineHCl100mgL–1、ThiamineHCl80mgL–1、Glycine400mgL–1。本专利技术所述的方法，直接对心皮进行表面消毒后，在无菌操作环境中再取出种子，既降低了污染率，还减少了消毒对种子带来的伤害，在培养的过程中，采用珠孔朝上的方式放置，大大减少了种子的褐化率。通过上述的操作可使得盛花期后最早30天的种子成功培养出可见胚，与现有技术的65天相比，种龄大大减小。本专利技术所述的方法，需要控制的最关键的因素是接种时珠孔的方向，启动培养基起到进一步促进的作用，本申请所述的改良MS培养基和标准的MS培养基在与本申请所述的激素进行组合后，均可成功培养，实验中发现本申请所述的改良MS培养基效果更好。优选的，所述步骤1)中，将种子从心皮中取出时，连带部分胎座一起从心皮中取出。实现中发现，在珠孔朝上的情况下保留部分胎座，在培养的过程中可进一步降低种子的褐化率，提高可见胚的形成率。实验操作中，将种子从心皮中取出的具体操作为，在超净工作台中用刀镊沿心皮腹缝线划开，力道合适，不接触到幼嫩种子，用手拨开心皮，连胎座一起将心皮内两侧种子整排取出到干净滤纸上，将整排种子用刀分成单个，再接到培养基中。优选的，接种时种子插入培养基中的深度不深，立稳即可。优选的，步骤1)中一般培养30左右至出现可见胚。优选的，选择盛花期后40～50天的心皮。优选的，所述成苗培养基的组成为，所述改良MS培养基或MS培养基+0.55～0.65g·L-1AC+0.8～1.2mg·L-1GA。进一步优选的，所述启动培养基的组成为：所述改良MS培养基或MS培养基+0.25mg·L-1BA+0.25mg·L-1GA；进一步优选的，所述启动培养基的组成为：所述改良MS培养基或MS培养基+0.6g·L-1AC+1.0mg·L-1GA。优选的，所述启动培养基和成苗培养基的pH为6.0。优选的，所述心皮表面消毒的具体操作为，将心皮用含有洗洁精的水浸泡，用刷子洗净每个心皮表层的绒毛，然后将其置于超净工作台中，在紫外灯下杀菌25～35min，翻转心皮再进行紫外灯杀菌25～35min，然后使用70％酒精处理2～4min、5％次氯酸钠处理10min，次氯酸钠重复一次处理，最后用无菌水冲洗3-4遍。优选的，所述步骤1)中的培养条件为在温度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牡丹幼胚的组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：1)对盛花期后30天或之后的心皮进行表面消毒，取出心皮中的种子，珠孔朝上，接种于启动培养基上，培养至出现可见胚；所述启动培养基的组成为：改良MS培养基或MS培养基+0.2～0.3mg·L

【技术特征摘要】
1.一种牡丹幼胚的组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：1)对盛花期后30天或之后的心皮进行表面消毒，取出心皮中的种子，珠孔朝上，接种于启动培养基上，培养至出现可见胚；所述启动培养基的组成为：改良MS培养基或MS培养基+0.2～0.3mg·L-1BA+0.2～0.3mg·L-1GA；2)将所述可见胚接种于成苗培养基中，至培养生出幼苗；所述改良MS培养基的组成包括：大量元素CaCl2·2H2O8800mgL–1、KH2PO41700mgL–1、KNO319000mgL–1、MgSO4·7H2O3700mgL–1、NH4NO316500mgL–1；微量元素CoCl2·6H2O5mgL–1、CuSO4·5H2O5mgL–1、Na2EDTA7460mgL–1、FeSO4·7H2O5560mgL–1、H3BO31240mgL–1、KI166mgL–1、MnSO4·H2O4460mgL–1、Na2MoO4·2H2O50mgL–1、ZnSO4·7H2O1720mgL–1；有机成分Myo-Inositol20000mgL–1、Nicotinicacid100mgL–1、PyridoxineHCl100mgL–1、ThiamineHCl80mgL–1、Glycine400mgL–1。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，将种子连带部分胎座一起从心皮中取出。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，选择盛花期后40～50天的心皮。4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述成苗培养基的组成为，所述改良MS培养基或MS培养基+0.55～0.65g·L-1AC+0.8～1.2mg·L-1GA。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：成仿云，徐莉，钟原，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11