针对转基因大豆dsABS品系的特异性PCR检测方法技术

本发明专利技术属于转基因食品检测技术领域，具体涉及一种针对转基因大豆dsABS品系的检测方法专利申请事宜。该方法须先设计引物Primer‑F和Primer‑R，然后包括提取待检测大豆样品的DNA、PCR扩增、电泳检测、判定等步骤。本申请针对转基因大豆dsABS品系开发设计，只要待测样品中含有不小于0.05%质量比例的转基因大豆dsABS品系时，均可检出，表现出较高的灵敏性，总体而言，具有特异性强、灵敏度高、检测结果准确可靠等优点，可为转基因大豆dsABS品系的种植监测、品种检测等奠定良好的方法学基础，具有较好的实用价值。

【技术实现步骤摘要】
针对转基因大豆dsABS品系的特异性PCR检测方法
本专利技术属于转基因食品检测
，具体涉及一种针对转基因大豆dsABS品系的检测方法专利申请事宜。
技术介绍
在对进行转基因植物及其加工产品进行成分定性检测时，可根据其检测的特异性分为筛选检测方法、基因特异性检测方法和品系特异性检测方法等。其中品系特异性检测是通过检测插入载体与植物基因组的连接区序列实现的。由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，因此品系特异性具有更高的特异性和准确性，最适合做转基因产品检测。根据《转基因植物及其产品成分检测》国家标准，品系特异性检测方法中往往对特异性PCR反应扩增的产物有一定要求，即：长度120~300bp之间、扩增条带单一、并可用于多种仪器进行结果显示。只有符合这些要求，才能较好满足检测快速、准确、特异的要求，才能更加方便应用于转基因产品成分检测。就转基因大豆dsABS品系而言，该品系是由美国俄亥俄州立大学和中国热带农业科学院热带生物技术核技术研究所开发的大豆新品系。该品系以非转基因大豆（Glycinemax）栽培品种Throne为受体，通过农杆菌介导法导入同时含有苜蓿花叶病毒、菜豆荚斑点病毒和大豆花叶病毒复制酶基因保守序列的发夹结构，因此该品系具有极好的同时抗苜蓿花叶病毒、菜豆荚斑点病毒和大豆花叶病毒三种病毒的能力。该品系目前正在一定范围内用于进一步的试验、推广种植阶段。但现有技术中尚未建立较好的针对该品系的检测方法，而建立一种较好的针对转基因大豆dsABS品系的特异性PCR检测方法，对于今后有效的对该转基因品系的推广种植及监控具有十分重要的技术意义和应用价值。
技术实现思路
本申请主要目的在于提供一种针对转基因大豆dsABS品系的特异性PCR检测方法，从而为对该品系的准确和有效检测奠定基础。本申请所提供的技术方案详述如下。一对用于转基因大豆dsABS品系检测用PCR引物，该引物根据转基因大豆dsABS的转化载体3'端及侧翼大豆序列(所述侧翼大豆序列如SEQIDNO.1所示)设计而成，包括Primer-F和Primer-R，引物序列如SEQIDNO.2~3所示，具体为：Primer-F：5'-GAGAGGCGGTTTGCGTATTGGCTA-3'，Primer-R：5'-ACACTGTTCGCTCGCACTTATCTACT-3'。一种针对转基因大豆dsABS品系的特异性PCR检测方法，具体包括如下步骤：（1）提取待检测大豆样品的DNA；具体例如采用：CTAB法、异硫氰酸胍法或盐酸胍法等各种从植物材料中提取DNA的方法；（2）利用上述所设计引物Primer-F和Primer-R，以步骤（1）中所提取DNA为模板，进行PCR扩增；PCR扩增时，25μL扩增体系设计如下：10×PCR缓冲液，2.5μL，dNTPs混合溶液，2μL，引物Primer-F，10μmol/L、1.0μL；引物Primer-R，10μmol/L、1.0μL；EasyTaq酶，5U/μL、0.2μL；步骤（1）中所提取的DNA模板，25mg/L、2.0μL；双蒸水加至25μL；PCR扩增条件为：94℃、5min；94℃、20s，58℃、20s，72℃、50s，35个循环；72℃、2min；（3）对步骤（2）中PCR扩增产物进行电泳检测，根据是否能扩增到预期的特定片段确定待测大豆样品的品系特异性，判定标准为：如果PCR扩增片段大小与预期的特异性片段一致，表明待测样品含有转基因大豆dsABS；如果没有特异性扩增片段或扩增片段大小与预期的特异性片段不一致，则待测样品不含有转基因大豆dsABS；所述特异性片段序列，包括320bp，如SEQIDNO.4所示，具体为：GAGAGGCGGTTTGCGTATTGGCTAGAGCAATTCGGCGTTAATTCAGTACATTAAAAACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTCTAAGCGTCAATTTGTTTACACCACAAGAAGGAAATATCACAACAAAAAAGGCAACAAGAAAAAAAAATGCAATACCACGTTAATCCAGATTGCTAATTAAATCTGAATGAGACATACAAAGCAAAACCAAGGTGATAAATCTGAACAAGACATCTAATACCTTAATCTATGTTCCACTCTTTGTCGTTAAAGGCACCATTCGCAGTGGTATAGTAGATAAGTGCGAGCGAACAGTGT。以常规大豆和转基因大豆dsABS、Mon89788、CV127、A5547-127、CTST-3-2以及其它转基因植物（油菜GT73、水稻TT51、玉米Mon810、玉米Bt176等）作为待检材料，利用本申请所提供的针对转基因大豆dsABS品系的特异性PCR检测方法进行初步的定性检测后，PCR扩增结果表明，仅在转基因大豆dsABS基因组中扩增得到了目的片段大小的条带(320bp)，而在其它转基因植物以及常规大豆等基因组中没有扩增得到目的片段大小的片段。进一步测序分析表明，待检转基因大豆dsABS基因组中扩增获得的序列与目的扩增片段序列一致。这一结果表明，本申请所建立的转基因大豆dsABS品系特异性定性PCR检测方法具有较强的特异性。分别以待测样品中含有1%、0.5%、0.1%、0.05%质量比例的转基因大豆dsABS品系为例，进一步对本申请所提供的针对转基因大豆dsABS品系的特异性PCR检测方法的检出限进行检测判定，结果表明，该方法的检出限为0.05%，即，只要待测样品中含有不小于0.05%质量比例的转基因大豆dsABS品系时，均可检出，表现出较高的灵敏性。总体而言，本申请具有特异性强、灵敏度高、检测结果准确可靠等优点，可为转基因大豆dsABS品系的种植监测、品种检测等奠定良好的方法学基础，具有较好的实用价值。附图说明图1为PCR扩增后产物的电泳结果，其中：1~3为转基因大豆dsABS，4为空白对照，M为2000DNAmarker；图2为方法特异性（准确性）检测，其中：M为2000DNAmarker，1为空白对照，2~6分别为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5；图3为方法检测限（灵敏性）结果，其中：M为2000DNAmarker，1为空白对照，2~5分别为转基因大豆dsABSDNA拷贝数为20000、2000、200、20和2的样品。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分生物材料、实验试剂、实验设备等背景情况简要介绍说明如下。生物材料：常规大豆，为以非转基因大豆（Glycinemax）栽培品种Throne；转基因水稻TT51，转基因玉米Mon810、Bt176，转基因大豆Mon89788、CV127、A5547-127、CTST-3-2，均为常见的研究用转基因植物或国外种植用转基因植物品种；转基因大豆dsABS，申请人作为该品系开发者之一，因此保留有该材料；相关引物及测序均由上海生物工程技术服务有限公司提供和完成；实验试剂：PCR扩增用10×PCR缓冲液、dNTPs混合溶液、EasyTaq酶等试剂均购自宝生物（大连）有限公司；植物DNA分离试剂盒、质粒提取试本文档来自技高网...

【技术保护点】
一对转基因大豆dsABS 品系检测用PCR引物，其特征在于，该引物对包括Primer‑F和Primer‑R，引物序列如SEQ ID NO.2~3所示，具体为：Primer‑F ：5'‑GAGAGGCGGTTTGCGTATTGGCTA‑3'，Primer‑R ：5'‑ACACTGTTCGCTCGCACTTATCTACT‑3'。

【技术特征摘要】
1.一对转基因大豆dsABS品系检测用PCR引物，其特征在于，该引物对包括Primer-F和Primer-R，引物序列如SEQIDNO.2~3所示，具体为：Primer-F：5'-GAGAGGCGGTTTGCGTATTGGCTA-3'，Primer-R：5'-ACACTGTTCGCTCGCACTTATCTACT-3'。2.利用权利要求1所述用于转基因大豆dsABS品系检测用PCR引物的一种针对转基因大豆dsABS品系的特异性PCR检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：（1）提取待检测大豆样品的DNA；（2）利用引物Primer-F和Primer-R，以步骤（1）中所提取DNA为模板，进行PCR扩增；（3）对步骤（2）中PCR扩增产物进行电泳检测，根据是否能扩增得到预期的特定片段确定待测大豆样品的品系特异性，判定标准为：如果PCR扩增片段大小与预期的特异性片段一致，表明待测样品含有转基因大豆dsABS；如果没有特异性扩增片段或扩增片段大小与预期的特异性片段不一致，则待测样品不含有转基因大豆dsABS；所述特定片段序列，包括320bp，如SEQIDNO.4所示，具体为：GAGAGGCGGTTTGCGTATTGGCTAGAGCAATTCGGCGTTAATTCAGTACATTAAAAACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTCTAAGCGTC...

【专利技术属性】
技术研发人员：张秀春，吴坤鑫，武亚丹，张春微，刘志昕，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46