TNFr与稳定性和抗聚集性增强的Fc片段融合蛋白及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种TNFr与稳定性和抗聚集性增强的Fc片段融合蛋白及其制备方法与应用。本发明专利技术通过将TNFr‑Fc融合蛋白的Fc段的CH2和CH3结构域分别引入一对二硫键，得到了突变型的TNFr‑S23融合蛋白，和野生型的TNFr‑Fc相比，其稳定性更好，可降低蛋白的生产、纯化、保存成本；同样和野生型的TNFr‑Fc比，其抗聚集能力更好，可降低因为蛋白的聚集而导致临床使用风险。

【技术实现步骤摘要】
TNFr与稳定性和抗聚集性增强的Fc片段融合蛋白及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物
，具体地指一种TNFr与稳定性和抗聚集性增强的Fc片段融合蛋白及其制备方法。
技术介绍
人肿瘤坏死因子(TNF-α)是一种活化的单核/巨噬细胞产生的细胞因子，并具有多种生物学效应。TNF-α能够诱导肿瘤细胞坏死或凋亡，且同时是介导炎症反应的主要细胞因子。重组人II型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(TNFr-Fc)是一种由美国FDA批准的，可用于治疗如类风湿性关节炎等自身免疫疾病的蛋白药物。Etanercept(EnbrelTM)是已经上市的商品化的TNFr-Fc融合蛋白，也是抗TNF最有效的药物之一，也是生物技术药物中销售非常高的产品。中国中信国建所生产的TNFr-Fc融合蛋白已生产上市，商品名为益赛普，用于治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎的骨和关节损伤。然而，这些抗体药物以及Fc融合蛋白作为生物活性大分子，它也有自身的局限性，如稳定性差、抗聚集能力弱，在其表达、纯化、贮存等过程中，会倾向于聚集或者降解。而蛋白聚集所导致的免疫原性，不仅降低了药效，同时也给临床应用带来很大的风险。因此，提高抗体稳定性与抗聚集能力是该领域亟待解决的问题之一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中Fc融合蛋白稳定性差、抗聚集能力弱的缺陷，提供一种TNFr与稳定性和抗聚集性增强的Fc片段融合蛋白及其制备方法与应用，与现有TNFr-Fc融合蛋白相比，它具有稳定性更好、更加抗聚集的特点，从而有助于提高TNFr-Fc的药效，减少由于不稳定或者容易聚集而带来的副作用。为实现上述目的，本专利技术提供了一种TNFr与稳定性和抗聚集性增强的Fc片段融合蛋白，其氨基酸全长序列为SeqIDNo.3，命名为TNFr-S23。可选地，所述TNFr-S23的编码基因序列为SeqIDNo.4。本专利技术还提供了上述TNFr与稳定性和抗聚集性增强的Fc片段融合蛋白的制备方法，其步骤如下：(1)获取人源IgG野生型Fc和TNFr的基因；(2)设计引物将野生型Fc中的指定氨基酸碱基突变成编码半胱氨酸的碱基，扩增出得到突变型Fc；(3)通过搭桥PCR的方法将TNFr与突变型Fc的基因进行融合得到完整的TNFr-S23基因；(4)以TNFr-S23基因序列构建真核表达载体，转染哺乳动物细胞，进行真核表达，纯化得到目的蛋白。本专利技术还揭示了上述TNFr与稳定性和抗聚集性增强的Fc片段融合蛋白，在制备治疗自身免疫疾病的药剂中的应用。本专利技术是通过将TNFr-Fc融合蛋白的人源抗体IgG的Fc段的CH2和CH3结构域分别引入一对二硫键，进而提高分子的稳定性和抗聚集能力。本专利技术的有益效果：(1)相对于野生型的TNFr-Fc，其稳定性更好，可降低蛋白的生产、纯化、保存成本；(2)相对于野生型的TNFr-Fc，其抗聚集能力更好，可降低因为蛋白的聚集而导致临床使用风险。附图说明图1为TNFr-Fc、TNFr-S23蛋白的表达纯化后蛋白免疫印迹检测图。图2为TNFr-Fc、TNFr-S23蛋白的表达纯化后SDS电泳图。图3为TNFr-Fc、TNFr-S23分子的存在形式分析图(单体、二聚体等)；其中A为益赛普，B为Etanercept，C为TNFr-Fc，D为TNFr-S23。图4为TNFr-Fc、TNFr-S23蛋白在变性剂条件下的稳定性比较图。图5为TNFr-Fc、TNFr-S23蛋白的抗聚集性比较图。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步的详细描述。以下实施例是在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例1：扩增TNFr-Fc、TNFr-S23片段基因采取人源血样，用TrizolReagent(Invitrogen公司)抽提细胞总RNA，得到的细胞总RNA溶解于50μL无RNA酶的水中。然后用M-MLV逆转录酶试剂盒(Promega公司)，采用随机引物，逆转录得到cDNA。根据IgG的Fc的基因序列(GenBank:KJ905798.1)，分析其氨基酸序列，设计Fc基因的正、反向引物扩增目的片段：正向引物5-GAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACAC-3(1)5-ACGCGGCCCAGCCGGCCTTGCCCGCCCAGGTGGCATTTAC-3(2)(横线标注为SfiI酶切位点)；反向引物5-GCCCTCCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3(1)(横线标注为XhoI酶切位点)5-GTCGCCAGTGCTCCCTTCAGCTGGG-3(2)分别用正向引物(1)/(2)与反向引物(1)/(2)以cDNA为模板进行PCR，得到Fc和TNFr基因片段，再利用点突变试剂盒将Fc片段四个氨基酸突变成半胱氨酸，得到S23基因片段。再设计搭桥PCR引物：T-Fc+-F正向引物5-ACGCGGCCCAGCCGGCCTTGCCCGCCCAGGTGGCATTTAC-3T-Fc--R反向引物5-GCCCTCCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3T-Fc--F正向引物5-CAAAACTCACACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAAC-3T-Fc+-R反向引物5-GTTCAGGTGCTGGGGACGGTGGGGATGTGTGAGTTTTG-3分别将TNFr和Fc/S23进行搭桥PCR，得到TNFr-Fc和TNFr-S23基因。琼脂糖凝胶电泳回收TNFr-Fc、TNFr-S23基因片段，用SfiI和XhoI酶切TNFr-Fc、TNFr-S23基因和载体Psectag2A，胶回收后将TNFr-Fc、TNFr-S23基因与载体Psectag2A连接、转化E.coliTop10感受态，随后挑取单克隆送测序。根据测序结果，挑取序列正确的单克隆用于后续实验。TNFr-Fc的基因序列为：SeqIDNo.2，其编码的氨基酸序列为SeqIDNo.1。TNFr-S23的基因序列为：SeqIDNo.4，其编码的氨基酸序列为SeqIDNo.3。实施例2：表达并纯化TNFr-Fc、TNFr-S23将TNFr-Fc、TNFr-S23质粒各40ug利用PEI(2mg/mLPEI)(Polyethylenimine“Max”,(Mw40,000)-HighPotencyLinearPEI,Polysciences,Inc.,CatalogNo.:24765-2,2g)转染293F细胞，分别用293F表达培养基(invitrogen)40ml于37℃、150rpm摇床培养6天。随后，离心(6000g，4℃，15min)收集293F细胞上清(上清以鼠抗人IgGFc为第一抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG为第二抗体进行蛋白免疫印迹检测，结果如图1所示，泳道1：Marker；泳道2：TNFr-Fc细胞上清；泳道3：TNFr-S23细胞上清)，将收集的上清过滤后，用ProteinG填料(GE公司)纯化TNFr-Fc、TNFr-S23蛋白。随后用截留分子量为10kD的超滤离心管(MerckMillipore公司)超滤浓缩该目的蛋白，经SDS-PAGE验证其纯度，如图2所示，泳道2为TNF本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种TNFr与稳定性和抗聚集性增强的Fc片段融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸全长序列为Seq ID No.3。

【技术特征摘要】
1.一种TNFr与稳定性和抗聚集性增强的Fc片段融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸全长序列为SeqIDNo.3。2.根据权利要求1所述TNFr与稳定性和抗聚集性增强的Fc片段融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因序列为SeqIDNo.4。3.一种权利要求1所述TNFr与稳定性和抗聚集性增强的Fc片段融合蛋白的制备方法，其步骤如下：(1)获取人源IgG野生型Fc和TNFr的基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚睿，
申请(专利权)人：武汉班科生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42